流式细胞检测课件

细胞研究的基础技术

流式细胞技术FLOW CYTOMETRY

王丽2015-07-07

细胞研究的基础技术

What does it mean?

CYTOMETRYCellMeasure(ment)

FLOW CYTOMETRY :在液流系统中，快速测定单个细 胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。Flow Cytometer (FCM) – 流式细胞仪

Flow Sorter – 流式细胞分选仪2

细胞研究的基础技术

流式细胞仪

BD FACSVantage

BD Calibur

Guava 5HT 微毛细管细胞分析仪

BECKMAN CytoFLEX3

Miltenyi MACSQuant

细胞研究的基础技术

流式细胞仪的组成FluidicsWaste

Optics

Electronics

Software4

细胞研究的基础技术

进样准备

样品规格： 96孔板 或 1.5 mL 小管5

细胞研究的基础技术

工作流程 样本制备 荧光染色 上样检测 数据分析Fluorescence Detector Histogram

Fluorescence

Blue Laser (488 nm)

Cell Suspension6

Fluorescently Labelled Antibody

YSingle Cell Suspension

+

细胞研究的基础技术

液流系统功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。 样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。

No Sheath Fluid

Sheath Fluid: ~10 mL/Test

Waste: <10ml /hr run 2千—1万 cells/Test

Waste:1L / hr run 10万—100万cells/Test

细胞研究的基础技术

微毛细管流动池Flow Rate = 0.1 - 1 ul / second

0.1mmProbe Volume = 200 pl

20mm

Volume = 200nl

50-100mm

Volume = 0.03 Volume = 0.02 Volume = 0.01

细胞研究的基础技术

光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。 Longpass460 500 540

Shortpass460 500 540

Bandpass460 500 540

LP 500

SP 500

BP 500/50

LP 500 = >500 nm9

SP 500 = <500 nm

BP 500/50 = 475 nm – 525 nm

细胞研究的基础技术

easyCyte 5HT system

激发光: 75 mW Blue Laser (488 nm) 检测荧光通道： Forward Scatter – FSC Side Scatter – SSC Green – 525/30 nm Yellow – 583/26 nm Red1 – 680/30 nm

细胞研究的基础技术

电子器件检测器 、光电二极管、光电培增管 功能: 1) 量化电压脉冲 2) 将模型信号转换 成数字信号

3) 荧光补偿4) 数据传给电脑以 便分析

细胞研究的基础技术

软件系统

细胞研究的基础技术

InCyte 开放模块- Flexibility

R2

整合多组 数据

R1

拖曳式设门，操 作简单易学 多种Plot 以供选择

分析方式 灵活

Heat-Map数据 分析直观化Work Station

13

Min/Max threshold

细胞研究的基础技术

测量参数

光散射强度荧光强度

样本体积细胞数目

细胞研究的基础技术

前向散射角和侧向散射角侧向散射角虽然也与细胞的形状与大小有关， 但是它对细胞膜、胞质、核膜的， 折射率更敏感。

前向散射角 Incident laser light“大小” 成正比例关系: 截面积大小 折射率 细胞形状

FSC: Forward angle light scatter – 区分细胞与细胞碎片 SSC: Side-angle (90 ) light scatter – 在细胞大小相同的情况下，区分不同的细胞种类。

细胞研究的基础技术

Scatter – How it worksSSCLaser Light

SSCLaser Light

单核细胞 FSC

SSCLaser Light

Side Scatter0

粒细胞 FSC

200

400

600

800

1000

淋巴细胞 FSC

Forward Scatter