分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活

分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活

http:ΠΠhttp://doc.guandang.net　　　　　化学通报　2001年第10

期 659 实验技术

分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活

黄锡荣　张文娟　宋少芳　李越中　曲音波11122

(1山东大学胶体与界面化学教育部重点实验室;2山东大学微生物技术国家重点实验室　济南　250100)摘　要　通过对胶束酶学对传统脂肪酶酶活测定的改进,建立了适合于油包水微乳液体系中脂肪

酶酶活测定的分光光度方法。与传统方法相比,本法克服了底物乳化液难配制、不稳定等缺点,无需进

行在pH缓冲溶液体系中的酸碱滴定,提高了酶活测定的准确性。

关键词　微乳液　分光光度技术　脂肪酶酶活测定　实验教学

Abstract　Basedonmicellarenzymology,amodifiedexperimentlipaseinthisreport,

whichisintendedforthesestudentswhomajororminorinmethodhassomemeritsovertheconventionaloneinthemediumandKeywords　Microemulsion,Soflipaseactivity,Laboratoryinstruction

(简称油)在适当配比条件下自发形成的热力学稳定、光学透明、。它既可以作为油溶性物质的溶剂,又可作为水溶性酶的分散介质。(OΠW)型(即油分散在水中)和油包水型(WΠO)(即水分散在油中,低水含量的微乳液也叫反胶束)。在油包水型微乳液中,酶分子被包裹在小水滴(也叫小水池(water

[1]pool))中,其物理图像可参见有关文献。

脂肪酶催化水解甘油三酯反应是在油Π水界面上进行的。其催化效率不但取决于活性(浓度),还取决于反应体系界面积大小。为了获得高的催化效率,其水不溶性底物如橄榄油、三油酸甘油酯等必须分散在水中,即借助于表面活性剂形成底物的乳状液。过去“脂肪酶酶活测定”这一基础生

[2]化实验一直是在橄榄油乳化液体系中进行的。这一乳状液体系有一些缺点,如制备麻烦(需用超

声波装置),且不稳定易分层。此外,由于超声条件的差异,常常造成乳液液滴大小不均,实验重复性不好。再者,乳状液体系是不透明的,不适合于用光学手段对底物或产物进行测定。如将底物增溶在油包水微乳液介质中则可避免上述缺点。除此外,由于微乳液中水滴的大小远小于乳化液中的油滴,因此,微乳液体系的界面积要比乳化液大得多,这有利于界面激活脂肪酶发挥其催化作用。更重要的一点是脂肪酶活性大小可以通过变更水与表面活性剂的物质的量之比(这是微乳液的特征参数,与水滴大小有关)来调控。

关于反胶束体系中各种酶的酶学性质研究,在过去的20年里一直是胶体与界面化学家与分子

(micellarenzymology)这一前沿交叉学科[1]。该研究不仅生物学家研究的热点,并形成了“胶束酶学”

在生物合成与转化领域里有着巨大的应用前景,而且对加深理解天然磷脂体系中酶蛋白的功能也

黄锡荣　男,37岁,副教授,主要从事分析化学教学与胶束酶学研究工作。高等学校重点实验室访问学者基金资助

2000208228收稿,2000212230修回

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org有重要帮助。因此,微乳液体系中脂肪酶酶活测定具有很大教学意义。

在给定时间内,脂肪酶酶活大小与其催化水解生成的脂肪酸的物质的量成正比。在基础生化

[2]实验教材中,生成的脂肪酸含量几乎都是用酸碱滴定方法来定量的。由于该体系中含有pH缓

冲液,这种定量分析方法常常令学生们困惑。此外,耗碱体积小及指示剂终点变色不明显也造成该滴定方法不准确、不灵敏。分光光度方法可以弥补酸碱滴定方法的不足。

[3]用分光光度法来测定脂肪酸的含量已有文献报道。它是基于脂肪酸与铜离子形成铜皂,经

苯萃取后进行比色测定(铜皂在715nm附近有一宽的吸收峰)。在此基础上经条件摸索优化,笔者开发出了适合于微乳液体系中脂肪酶酶活测定的分光光度技术。

1　实验

111　试剂

琥珀酸二辛酯磺酸钠(AOT,纯度>99%,Sigma公司);异辛烷(含大约0102%的水,色谱纯,Sigma公司);脂肪酶(L21754,Sigma公司);三油酸甘油酯(Sigma公司);油酸、吡啶、苯、醋酸铜、Na2HPO4及KH2PO4均为分析纯。

112　实验步骤

配制50mmolΠLAOT的异辛烷溶液;pH=712的66ol44缓冲溶液;以磷酸缓冲液为溶剂配制011mgΠmL的脂肪酶酶液;5(2在CuAc2水溶液中滴加吡啶配成pH=6.0(在pH计上调控)的2取两只50mL,415mL50mmolΠLAOT的异辛烷溶液和015mL

μL110mgΠmL的酶液于一只瓶中(作样品),另一只瓶中加三油酸甘油酯,μ入45L6617mm(作空白),将两只锥形瓶放入30℃的恒温振荡水浴中保温(转速为150rΠmin)。后,用微量进样器从锥形瓶中各移出014mL反应液于两支10mL具塞离心管中,然后用刻度移液管在每只离心管中再加入416mL苯和110mL5%的CuAc2Π吡啶溶液,快速涡流混合,终止酶促反应。手工振摇2min后,放入离心机中离心5min。各取上清液于1cm玻璃比色皿中,以空白为参比,测加酶反应液样品在715nm处的吸光度A。根据吸光度A值,在油酸工作曲线上用内插法计算出油酸含量,再根据酶活定义算出酶活及比活。

2　结果与讨论

μ在检测条件下,1min内产生1mol油酸所需的脂肪酶量定义为一个活性单位(u)。对同一商品

脂肪酶,用本法测得的比活性为2610±018uΠmg,用传统方法(于100mL碘量瓶中加入510mL磷酸缓冲液(pH=712)和510mL25%油酸三甘油酯(聚乙烯醇为乳化剂),放入30℃的恒温振荡水浴中,5min后加入215mg酶粉,保温20min后,取出碘量瓶,加10mL95%乙醇,以酚酞作指示剂,用

)测得的比活性为819±0105molΠLNaOH滴至粉红色为止。011uΠmg。

由于微量的酶粉很难称准并重复,故事先将酶粉配成酶液更易操作。室温条件下,酶液可稳定12h。微乳液中脂肪酶底物对酶有一定的稳定作用,因此三油酸甘油酯最好在酶液加入前加入。实验发现,形成微乳液的水来自酶液,而水含量对酶活又有较大影响,因此,酶液的体积应加得比较准确些。实验中为降低AOT对后续萃取步骤的影响,当苯的体积与取样体积之和控制在510mL时取样体积不应超过015mL。为此,可以通过调整酶浓度使水解产生的脂肪酸量落在油酸工作曲线的线性范围内。油酸工作曲线的绘制方法类似于上述实验步骤,只是样品为415mLAOT的异辛烷溶

μ液+015mL三油酸甘油酯+45L磷酸缓冲液+一定体积的油酸标准品,而空白为415mLAOT的异

μμ辛烷溶液+015mL三油酸甘油酯+45L磷酸缓冲液。在215～15L油酸范围内,吸光度A与所加

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http:ΠΠhttp://doc.guandang.net　　　　　化学通报　2001年第10期 661 标准品油酸的体积成线性关系。若密度按01894计,分子量按28215计,此范围内油酸重212～

μ1314mg,相当于719～4715mol油酸。

3　结语

本文建立了适合于微乳液体系中脂肪酶酶活测定的分光光度方法。微乳液体系的引入和分光光度技术的采用克服了传统脂肪酶酶活测定中底物乳化液难配置、不稳定等缺点,避免了在pH缓冲溶液体系中进行酸碱滴定这一常令学生困惑的问题。此外,光分析技术的采用,也大大提高了酶活测定的准确性。

参考文献

[1]　MartinekK,KlyachkoNL,KabanovAVetal.Biochim.Biophys.Acta,1989,981:161.

[2]　李建武,萧能赓,余瑞元等1生物化学实验原理和方法.北京:北京大学出版社,1994.

[3]　LowryRR,TinsleyIJ.J.Am.OilChem.Soc.,1976,53:470. 信息服务

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