3TSR体内外诱导内皮细胞凋亡的实验研究

3TSR体内外诱导内皮细胞凋亡的实验研究

3TSR体内外诱导内皮细胞凋亡的实验研究

金洲祥 朱少俊 张雪峰 徐鲁白 王继生

摘要 目的 研究血管形成抑制剂3TSR体内外对内皮细胞的影响

,并探讨与

caspase-3的关系。方法 在体外培养条件下比较对照组、不同剂量3TSR(1umol/l～3umol/l)作用48h对人脐静脉血管内皮细胞增殖及凋亡的影响，并用RT-PCR法检测各组caspase-3 mRNA转录水平。建立裸鼠原位胰腺癌模型，进行随机干预实验，比较对照组(每日0.2ml生理盐水腹腔注射)、3TSR1组(每日1mg/kg腹腔注射)、3TSR2组(每日2mg/kg腹腔注射)及3TSR3组(每日3mg/kg腹腔注射)，每组6只，3周后检测胰腺癌原位肿瘤血管内皮细胞凋亡率。结果 体外培养时3TSR对人脐静脉内皮细胞有显著增殖抑制及凋亡诱导作用，作用48h后其凋亡率分别为(10.3±3.2)%，(12.4±4.1)%和(20.1±5.4)%，均显著高于对照组(P<0.05)。3TSR1组、3TSR2组和3TSR3组caspase-3 mRNA转录水平相对强度分别(0.76±0.11),(0.79±0.21)和(0.89±0.19),均显著高于对照组(P<0.05)，且随浓度增加而增强。体内实验时3TSR能显著诱导胰腺癌血管内皮细胞凋亡, 3TSR1组、3TSR2组及3TSR3组凋亡率分别为(7.8±3.0)%， (14.6±4.9)%和(15.9±3.2)%，均显著高于对照组(P<0.05)。结论 3TSR体内外均能诱导内皮细胞的凋亡，且呈一定的浓度依赖性，其作用机制可能与促进caspase-3基因转录有关。 关键词：3TSR； 内皮细胞；胰腺癌；凋亡；增殖

The effects of 3TSR on apoptosis of vascular endothelial cells and its relationship with caspase-3 mRNA

Zhouxiang Jin*, Shaojun Zhu ,Xuefeng Zhang,et al.*Department of Surgery, The second affliated hospital of Wenzhou medical college, Wenzhou,Zhejiang , 325027, China.

[ABSTRACT] Objective To investigate the effects of angiogenic inhibitor 3TSR on

vascular endothelial cells in vtiro and in invo, and explore its relationship with 资金项目：浙江省教育厅自然科学基金资助（项目编号20051188）

作者单位:325027 温州,温州医学院附属第二医院普通外科（金洲祥，朱少俊，徐鲁白，王继生）;美国哈佛医学院Beth Isreal Deaconess医学中心外科系（张雪峰） 通信作者：金洲祥，E-mail:jzx0847＠http://doc.guandang.net

3TSR体内外诱导内皮细胞凋亡的实验研究

Methyl thiazolyl tetrazolium expression caspase-3 mRNA. MTT and Annexin V-FITC method were used to detect the cell growth status and apoptosis rate of cells after treatment by 3TSR of different dosage

(1umol/l～3umol/l). The expression of

caspase-3 mRNA was detected by RT-PCR .Human pancreatic carcinoma cells were inoculated in pancreas of BALB/c mice ,and then the mice were pided into four groups:control group,3TSR1(1mg/kg) group, 3TSR2(2mg/kg) group and 3TSR3(3mg/kg) group, with 6 mice each group. The apoptosis rate of vascular endothelial cells in 3TSR-treated was detected, respectively,after treatment by three weeks.Results

3TSR inhibited the proliferation of HUVEC cells in a

concentration-dependent manner, as measured by MTT method. The apoptosis rates at 3TSR-treated groups after treatment for 48hr, measured by Annexin FITC, were

(10.3±3.2)%，(12.4±4.1)% and (20.1

±

5.4)%,respectively,significantly higher than those in control groups(P<0.05).The relative values of expression of caspase-3 mRNA in treated groups were 0.11),(0.79±0.21) and (0.89

(0.76±

±0.19),respectively.The values of

expression of caspase-3 mRNA were significantly higher than control group.In vivo the apoptosis rates of vascular endothelial cells volume in 3TSR1 group, 3TSR2 group and 3TSR3 group were (7.8±3.0)%,(14.6±4.9)% and (15.9±3.2)%,respectively,significantly higher than in control group.

Conclusions

These findings suggest that 3TSR may inhibt the proliferation and induce apoptosis of vascular endothelial cells in vitro and in vivo,the mechanisms of which may be related to the elevated expression of caspase-3 mRNA.

[Key words] 3TSR; Endothelial cells ; Proliferation;Pancreatic cancer; Apoptosis

TSP-1(Thrombspondin-1) 是一种最早发现的具有抗新生血管形成和抑制肿瘤生长的天然三聚体高分子糖蛋白，许多研究表明它对实质性肿瘤具有治疗作用，但大剂量应用有许多副作用，临床应用受到限制[1]。3TSR（Three hrombospondin-1 Type 1 Repeats ）是TSP-1抗新生血管形成的功能结构域，具有与TSP-1相似的抗新生血管形成作用而其他作用少，现人类的3TSR已经被哈佛医学院Beth Isreal

3TSR体内外诱导内皮细胞凋亡的实验研究

Deaconess医学中心病理实验室提纯，初步研究表明3TSR具有明显的抗肿瘤作用

[2]

。

我们的初步实验已经表明3TSR在体内能显著抑制胰腺癌肿瘤生长，抑制新生

血管生成[3]。为了进一步探讨其作用机制，我们设计实验观察了3TSR对体内外内皮细胞增殖和凋亡的影响，以明确3TSR的作用机制。

材料与方法

1．材料：人脐静脉血管内皮细胞株ECV304 购自中国医学科学院细胞库;DMEM细胞培养液(Gibcol);人类胰腺癌细胞株AsPC-1(American Type Culture Collection，VI)， 3TSR由Jack Lauler教授提供(Beth Israel Deaconess Medical Center，MA)，RPMI-1640细胞培养液（Life Technologies,NY）,胰蛋白酶（Sigma）, 四唑蓝（MTT）(R＆D systems,MN),鼠抗CD31（BD PharMingen,SanDiego,CA）,4’6-二脒基苯基吲哚(Vector Lab Inc.,Burlingame，CA)。凋亡FITC试剂盒(南京凯基生物)。Caspase-3 和β-actin引物序列,由北京奥科生物技术公司合成。RT-PCR试剂盒购自深圳晶美生物工程公司。

2．体外实验

（1）细胞培养:ECV304 在37℃、5 %CO2 条件下培养于含10 %小牛血清的DMEM 培养基中, 以0.25 %胰酶、0.02 %乙二胺四乙酸( EDTA)消化、传代。胰腺癌AsPC-1细胞使用含10%胎牛血清、2mmol/l L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的RPMI-1640的培养基，细胞置于37℃、100%相对湿度和含5%CO2空气的细胞培养箱中培养。

(2)分组：体外实验分为对照组（不加药物），3TSR1（1μmol/l）,组3TSR2（2μmol/l）， 3TSR3（3μmol/l）4组。

(3)细胞增殖测定：用四甲基氮唑蓝法(MTT)法检测药物对ECV304细胞生长的抑制作用。AsPC-1细胞接种于培养瓶中培育，24h后收集经培养液制成细胞悬液，加入96孔培养板（每孔细胞数为2×104个）中培养24h后，分为对照组、3TSR1（1μmol/l）组, 3TSR2（2μmol/l）组和3TSR3（3μmol/l）组,每组设3复孔，各组培养48h后，每孔加MTT溶液（5mg/ml）10ul,37℃继续孵育4h后，吸去孔内培养基，每孔加100ul的二甲基亚砜（DMSO），充分溶解后用Quant …… 此处隐藏：8588字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……