白细胞介素2对大鼠垂体前叶细胞雌激素受体蛋白含量和基因表达的

采用原代无血清细胞培养技术结合免疫组织(细胞)化学和半定量反转录-PCR方法,观察白细胞介素2(IL-2)对大鼠垂体前叶雌激素受体(ER)蛋白含量和基因表达的影响,以探讨IL-2和ER在大鼠垂体前叶的相互关系。结果表明:在无血清细胞培养条件下,IL-2可影响大鼠垂体前叶ER#alpha#和ER#bet

生理学报,Dec.2000,52(6):487～490　487　

ActaPhysiologicaSinica

白细胞介素2对大鼠垂体前叶细胞雌激素受体

蛋白含量和基因表达的影响3

张庆红,

朱运龙33,

胡玉珍,

张万会,

陈健康,

王复周

(第四军医大学基础部生理教研室,西安710032)

摘　要:　采用原代无血清细胞培养技术结合免疫组织(细胞)化学和半定量反转录2PCR方法,观察白细胞介素

2(IL22)对大鼠垂体前叶雌激素受体(ER)蛋白含量和基因表达的影响,以探讨IL22和ER在大鼠垂体前叶的相互

α蛋白含量,促进关系。结果显示:在大鼠垂体前叶细胞有IL22受体表达。在无血清培养条件下,IL22能增加ER

α基因表达,而对ERβ的作用正好相反。rhIL22(10μα阳性细胞平均光密度值从481740±ERg/L)作用48h后,ERβ从1021560±α41567增高到811188±61619,ER61250减少到721718±71623;ER/β2actinmRNA比值从011511增加β到014334,ER/β2actinmRNA比值从013822降低到011528。结果表明:在无血清细胞培养条件下,IL22可影响大鼠α和ERβ蛋白水平和基因表达,提示在大鼠垂体前叶IL22对ER有调控作用。垂体前叶ER

关键词:白细胞介素2;雌激素受体;信号转导;垂体学科分类号:Q459;R33816

Effectofinterleukin2ontheexpressionofestrogen

receptorsintheanteriorpituitaryofrats3

ZHANGQing2Hong,ZHANGWan2Hui,

ZHUYun2Long33,CHENJian2Kang,

HUYu2Zhen,WANGFu2Zhou

(DepartmentofPhysiology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032)

Abstract:　Usingprimaryserum2freecellculturecombinedwithimmunocytochemistryandsemi2quantified

α)andβ(ERβ)byinterleukin22(IL2RT2PCRmethods,weobservethemodulationofestrogenreceptorα(ER

αproteinandtheexpression2)inratanteriorpituitary.TheresultsshowthatIL22up2regulatesthelevelofER

αmRNA,butdown2regulatesthoseofERβ.ThedensitypercellofERαofER2immunoreactive(ir)cellsin2βcreasesfrom481740±41567to811188±61619,whereasthatofER2ircellsdecreasesfrom1021560±61250to721718±71623afterrhIL22(10μg/L)incubationfor48h.Inparallelwiththesechanges,theratio

αβofER/β2actinmRNAincreasesfrom011511to014334,andER/β2actinmRNAdeclinesfrom013822to011528.ItislikelythatIL22hasdirectregulatoryeffectonERinanteriorpituitary.Keywords:interleukin2;estrogenreceptor;signaltransduction;pituitary

　　白细胞介素2(IL22)是神经免疫内分泌系统间

共享的信息分子,它不仅调节淋巴细胞增殖和分化,对垂体前叶细胞增殖和激素分泌也有影响。雌激素受体(ER)是一种核受体,属于类固醇受体超家族,介导雌激素对垂体前叶细胞增殖和激素分泌作用[1]。ER有两个亚型,α和β,两者介导的信号转

　　Received2000204224　　Accepted2000206226

导效应几乎完全相反[2]。Newton等报道IL22能促进

GH3垂体瘤细胞系ER的转录活性,并可促进ER所调控的孕激素受体和催乳素蛋白水平升高[3]。本研究从细胞和分子水平观察了IL22对大鼠垂体前叶细胞ER表达的影响,以阐明细胞因子对神经内分泌系统可能的调节作用。

　　3SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No139870319)　　33Correspondingauthor.Tel:02923374571;E2mail:Zhuyl@fmmu1edu1cn

采用原代无血清细胞培养技术结合免疫组织(细胞)化学和半定量反转录-PCR方法,观察白细胞介素2(IL-2)对大鼠垂体前叶雌激素受体(ER)蛋白含量和基因表达的影响,以探讨IL-2和ER在大鼠垂体前叶的相互关系。结果表明:在无血清细胞培养条件下,IL-2可影响大鼠垂体前叶ER#alpha#和ER#bet

1　材料和方法

111　大鼠垂体前叶细胞原代培养　　雌性SD大鼠(150～200g)由本校动物中心提供。戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉,用无菌注射器从左心室向主动脉

中孵育1h,然后于95℃处理3min,用酚/氯仿/异

戊醇抽提,以乙酸钠/乙醇沉淀。将RNA沉淀溶解

小心去掉垂体后叶,收集垂体前叶于小瓶中剪碎。

于DEPC处理的水中,用分光光度计(HitachiU2

用0125%的胰酶和1%DNA酶(华美公司)1∶1消化

2001,Japan)测量RNA浓度,于-80℃保存备用。

2次,每次10～15min。用含血清的培养基终止胰酶

115　反转录合成　　在50μl的反应体积中加入5

的消化作用,离心10min,弃上清,将细胞重悬于含

μg总RNA,5×反应缓冲液10μl,10mmol/LdNTPs5

10%FCS的D/F12(Gibco)培养基中,细胞浓度为4

μl,Rnasin(WAKO,Japan40U/μl)015μl,oligod(T)

×105～5×105/ml,铺于90mm的培养皿中或24孔

12～15(GibcoBRL)0125μg,反转录酶(M2MLV,Gib2

板内用多聚赖氨酸包被的小盖玻片上,于含5%CO2

coBRL,200U/μl)3μl,011mol/LDTT015μl,置于

的37℃孵箱中孵育。第2天换有血清培养基,第4

37℃孵育1h,然后在65℃加热5min,储存于-天用无血清培养基洗2遍后,在加有添加剂的无血

20℃。

清培养液中继续培养48h。添加剂包括30nmol/Lβα、116　引物设计和合成　　按照已报道的ERER硒酸钠和10mg/L转铁蛋白(Sigma)、016g/L谷胺酰和β2actin的特异性引物序列,由AppliedBiosystems胺、5mg/L胰岛素、100μmol/L腐胺、5g/L葡萄糖、Model394DNA合成仪合成引物。ERα:正链5′2GGT1g/L牛血清白蛋白、青霉素、链霉素、10mmol/LCCAATTCTGACAATCGAGC23′,反链5′2TTTCGTHEPES(国产分析纯试剂)。最后在含添加剂的无血β:正链5′ATCCCGCCTTTCATC,304bp;ER2AAC胞。将大鼠浸于70%的酒精中10min,暴露垂体,清培养液中加入rhIL22(10μg/L,Promega),和对照

ACTTGCGAAGTCGGCAG23′,反链5′2AACCTCAAAAGAGTCCTTGGTGTG23′173bp;β2actin:正链5′2TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC23′,反链5′2CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA23′,265bp。合成

方向灌注无菌生理盐水20ml,冲净垂体中的血细

酮混合,室温孵育10min。于4℃以15000r/min离

心15min,弃上清。沉淀块用70%乙醇冲洗后,以20μlDEPC处理的去离子水溶解。将溶解的总RNA加入含0101mol/LTris2HCl、0105mol/LKCl、115mmol/LMgCl2、215mmol/LDTT、1UDnaseI(BoehringerMannheim,Germany)的溶液中,37℃水浴

组一起继续培养48h。

112　免疫组织(细胞)化学染色　　将雌性SD大鼠用戊巴比妥钠麻醉,经心脏插管至升主动脉,用生理盐水50ml冲去垂体中血液,将垂体固定于

的引物用18%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检Bouin′s液中4～6h,常规石蜡包埋,从垂体腹侧向测。

β和ERβ的ABC法117　背侧行厚7μm切片,进行IL22RPCR扩增　　在25μl的反应体积中加入合成

免疫组化双重染色。24孔板内小盖玻片上的细胞用的cDNA011μg,10×PCR缓冲液215μl,dNTPs(2

α或羊抗鼠ERβmmol/L)215μBouin氏液固定,进行兔抗鼠ERl,MgCl2(25mmol …… 此处隐藏：7288字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……