鱼鳞胶原蛋白水解度两种测定方法的比较

黄　焕,王　欣,刘宝林

(上海理工大学医疗器械与食品学院,上海200093)

摘　要:应用双指示剂甲醛滴定法和双缩脲比色法两种测定方法,对鱼鳞胶原蛋白的酶解后的水解度进行了检测。结果表明,双缩脲比色法测定的水解度比较直观地反映了从鱼鳞中酶解得到的胶原蛋白的多少,对于实验后期的误差分析有较大的帮助。

关键词:鱼鳞,胶原蛋白,水解度

ComparisonoftwomethodsofdeterminationofhydrolysisdegreeoffishscalecollHUANGHuan,WANGXin,LIU-lin

(SchoolofMedicalInstrumentandFoodforScienceand)

Abstract:Thetwomethodsofforltionatcolorimetwerecomparedtodeterminedegreeofhydrolysisoffishscalecog1uethat,theamountofcollagenwasalittlemoredirectlyshowedbythemethodofbiucolotnbthemethodofformol-titration,whichmayprovidegreathelpforthedeviationanalysingexperiments1

Keywords:fishscale;collagen;degreeofhydrolysis

中图分类号:TS25411　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1002-0306(2010)03-0354-03　　水解度(degreeofhydrolysis,DH)是衡量蛋白质水解程度的指标,一般指蛋白质分子中由于生物的或化学的水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键

[1-2]

的比例。水解后的蛋白质的一些功能性质发生了改变,如溶解性、乳化性、发泡性等,因而可广泛应用于食品工业。然而,在鱼鳞胶原蛋白的酶解程度分析中,其水解度的测定常采用双指示剂甲醛滴定法和双缩脲比色法。双指示剂甲醛滴定法是现在国内被广泛应用于测定胶原蛋白水解度的一种方法,

+

甲醛可与氨基酸上的-NH3结合,形成—NH-CH2OH、—N(CH2—OH)2等羟带基衍生物,使NH3

+

+

+

+

上的H游离出来,这样就可以用碱滴定NH3放出

H,测定酶解过程被释放出来的氨基,从而计算出水

解度。但是这种测定方法存在一定的问题,脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物,使结果偏低;酪氨酸含有酚羧基,滴定时会消耗一些碱而致使结果偏高。因此采用双指示剂甲醛滴定法测定富含脯氨

[2]

酸的原料,其结果偏低;测定微弱的水解物的水解度时,误差较大。双缩脲比色法是由于双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物,此反应称为双缩脲反应。而蛋白质分子中含有肽键,与双缩脲结构相似,故也能呈现此反应生成紫红色配合物,在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比,据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量,从而测定胶原蛋白的水解度。此法操作简单快速,测定微弱酶水解物的水解度时误差较小,但很少有比较这两种方法在实验研究中利与弊。本文对以用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶水解的鱼鳞胶原蛋白提取物用双指示剂甲醛滴定法和双缩脲比色法测定水解度,以比较两种方法在后续研究中的可行性。

1　材料与方法

111　材料与仪器

新鲜青鱼鱼鳞　浸泡洗净鱼鳞表面粘附物,40℃烘干备用;胃蛋白酶(酶活力1200U/g)、胰蛋白酶(酶活力2500U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活力6000U/mg)　中国医药(集团)上海化学试剂公司;中性蛋白酶　酶活力50U/mg,上海楷洋生物技术有限公司;鱼胶原蛋白　Weishardt公司提供;甲醛、百里酚酞、中性红、氢氧化钠、乙醇、甘油、氢氧化钾、硫酸铜、四氯化碳、碳

收稿日期:2009-04-17

作者简介:黄焕(1985-),女,硕士研究生,从事鱼鳞胶原蛋白的研究。基金项目:国家自然基金项目(50776060);上海市启明星项目

(07QA14042);新世纪人才项目(NCET-07-0559);上海市

教委重点学科项目(S30503)及上海市东方学者项目资助。

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酸钠、盐酸等　均为国产分析纯。

AB204-N型分析天平,SH2-88台式水浴恒温振荡器,UV-1700紫外可见分光光度计,电热恒温水浴锅。

DH2(%)=

×100%

鱼鳞总量

2　结果与讨论

211　双缩脲比色法标准曲线的绘制

取6支50mL纳氏比色管,分别加入标准鱼胶原蛋白溶液(10mg/mL)0、014、018、112、116、210mL,然后依次加入210、116、

112、018、014、0mL蒸馏水,再分别加入1mL四氯化碳,最后用碱性硫酸铜溶液准确稀释至50mL,振荡10min,静置1h,去上层清液离心5min。取离心分离后的透明液于比色皿中,在560nm波长下测定制取标准曲线,以蛋白质含量P为横坐标(单位mg),以吸光度A为纵坐标,并计算求出线性回归方程,结果如图1所示。

112　实验方法

11211　酶法提取鱼鳞胶原蛋白的工艺流程　鱼鳞→

3%盐酸溶液脱钙24h(12h换一次盐酸溶液)→饱和碳酸钠

溶液浸泡24h(12h换一次饱和碳酸钠溶液)→蒸馏水清洗→酶水解→过滤酶解液→测定水解度→冷冻干燥得到成品1121111　前处理顺序对DH的影响　取8份鱼鳞,经过不同的前处理(如表1)后,再分别用四种酶在表2所列的实验条件下水解6h。

表1　不同的前处理方法第一步第二步3%盐酸溶液饱和碳酸钠溶液

处理方法一脱钙24h(12h换浸泡24h(12h换一次

一次盐酸溶液)饱和碳酸钠溶液)饱和碳酸钠溶液3%盐酸溶液

处理方法二浸泡24h(12h换脱钙24h(12h

一次饱和碳酸钠溶液)换一次盐酸溶液)

1121112　酶解时间不同对DH的影响　用四种酶分别在表2所列的实验条件下水解提取鱼鳞胶原蛋白,均提取6h和12h。

表2　各种酶的水解鱼鳞胶原蛋白的水解条件酶的种类木瓜蛋白酶胰蛋白酶中性蛋白酶胃蛋白酶

酶浓度(%)

33

温度(℃5537

71561574

1:A=010044×P

-0100001,相关系数r=01999,线性关系显著。

212　双指示剂甲醛滴定法和双缩脲比色法测定酶鱼

鳞胶原蛋白水解产物

2

1211　前处理顺序对DH的影响　前处理的目的主

1121113　不同加酶量对DH的影响　取3份鱼鳞,经

前处理后用浓度为1%、2%、3%木瓜蛋白酶,在

pH=715,T=55℃,t=12h的条件下水解。11212　水解度的测定

[3]

1121211　双指示剂甲醛滴定法测定水解度

(V3-V2)×N×01014V1

氨基酸态氮(%)=W

V

×100%

式中:V1—酶解液过滤的体积;V2—用中性红作为指示剂时标准碱溶液的滴定量(mL);V3—用百里酚酞作指示剂时标准碱溶液的滴定量(mL);N:标准碱液的当量浓度;W:样品的重量;01014—氮的毫克当量;V:取样测量的体积。

原料总氮量测定:凯氏定氮法(GB500915-85)。

水解液氨态氮

DH1(%)×100%

原料总氮

[3]

1121212　双缩脲比色法测定水解度

C×V1

蛋白质(g)V2×1000

式中:C—由标准曲线上查得的蛋白质毫克数;V1—酶解液过滤的体积(mL);V2—取样测量的体积(mL)。

原料总蛋白质量测定:凯氏定氮法(GB500915-85)。按GB/T500915-2003中第一法测定,蛋白质的换算系数为5179。

要是脱除鱼鳞上的钙,以便于后期胶原蛋白的提取。

由图2、图3可见,在前处理时第一种处理方法明显优于第二种。原因主要是先用盐酸脱除鱼鳞上的钙后,使得胶原蛋白更易于脱离磷灰石晶格的束缚而

[4]

溶出,而用盐酸作为后序处理时,酶解后水解度偏低,原因是整个预处理环境起主要作用的是酸处理,如果用碱先处理,后期加入的酸必然有一部分,用于中和前期未能完全稀释和去除的碱,进而减少酸处理真正的作用量,以致适得其反,降低了前处理效果。

图2　前处理顺序对DH1的影响

比较两种测定水解度的方法,由图2可见,采 …… 此处隐藏：3291字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……