实验八 水中大肠杆菌的测定

实 验 八 水中大肠杆菌大的测定

一、实验目的和内容目的：学习检测水中大肠菌群的方法，了 解 大肠菌群数量与水质的关系 内容：1 内容：1、用滤膜法检测大肠菌群 2、用多管发酵法检测大肠菌群。

二、基本原理 基本原理大肠菌群是一类革兰氏阴性无芽孢杆菌，24h内 能发酵乳糖或半乳糖。滤膜法是采用滤膜过滤器过滤 水样，使其中的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在 选择性培养基上进行培养，根据大肠菌群菌落特征进 行分析和计数。多管发酵法包括初发酵、平板分离和 复发酵3个部分。初发酵中大肠菌群发酵乳糖产酸，产 气，根据培养基内指示剂颜色变化及杜氏小管内有无 气体，判断是否为阳性。平板分离一段利用大肠菌群 在复红亚硫酸钠琼脂或伊红美兰琼脂上形成深红色霍 紫色金属光泽菌落并结合革兰氏染色进行判断。

三、实验材料和用具1、培养基 复红亚硫酸钠培养基、乳 糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白胨 培养液、3倍浓乳糖蛋白胨培养液、伊 红美兰培养基。 2、仪器及用具 微孔滤膜(0.45um)、 滤器(500mL)、抽气设备、镊子、 发酵用试管、杜氏小管、培养皿、刻 度吸管或移液管、接种环、酒精灯。

四、操作步骤(一)水样的采集 1.自来水 将自来水龙头用火焰灼烧3min灭菌， 1.自来水 将自来水龙头用火焰灼烧3min灭菌， 在拧开水龙头流水5min,以排除管道内积存的死 在拧开水龙头流水5min,以排除管道内积存的死 水，随后用已灭菌的三角瓶接取水样。 2.池水、河水、或湖水 将无菌的带玻璃塞的小 2.池水、河水、或湖水 口瓶侵入距水面10~15cm深的水层中，瓶口朝 口瓶侵入距水面10~15cm深的水层中，瓶口朝 上，除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞， 取出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能 超过24h。 超过24h。

(二)滤膜法检测大肠菌群 1.无菌滤膜 1.无菌滤膜 无菌镊子 滤器膜承受器，过滤杯——滤膜承 滤器膜承受器，过滤杯—— ——滤膜承 受器，旋紧。真空泵—— ——抽气口 受器，旋紧。真空泵——抽气口 2.水100mL滤杯 启动抽真空系统，使水从下端流出。 滤杯， 2.水100mL滤杯，启动抽真空系统，使水从下端流出。 3.有细胞的滤膜 3.有细胞的滤膜 无菌镊子 平贴于复红亚硫酸钠固体培养 基上(紧贴，无气泡),37℃培养16~18h。挑选红色或紫 基上(紧贴，无气泡),37℃培养16~18h ),37℃培养16~18h。 红色、带有或不带有金属光泽的菌落，或淡红色、 红色、带有或不带有金属光泽的菌落，或淡红色、中心颜 色较深的菌落进行涂片和革兰氏染色观察。 色较深的菌落进行涂片和革兰氏染色观察。

4.经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者， 4.经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，接种到乳糖蛋白 经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者 胨半固体培养基上， 37℃培养6~8h后观察 培养6~8h后观察， 胨半固体培养基上， 37℃培养6~8h后观察，产气者为阳 观察要及时，以免气泡消失) 性(观察要及时，以免气泡消失) 5.结果计算 5.结果计算

(三)多管发酵法检测大肠菌群1.取5支装有3倍浓乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每支分别 1.取 支装有3 加入水样10mL。另取5 加入水样10mL。另取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵 管，每支分别加入水样1mL。再取5 管，每支分别加入水样1mL。再取5支装有乳糖蛋白胨培养 基的初发酵管，每支分别加入按1 10稀释的水样1mL,均 基的初发酵管，每支分别加入按1:10稀释的水样1mL,均 贴好标签。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。 贴好标签。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。 2.取出培养后的发酵管，观察发酵液的颜色为黄色者记录为 2.取出培养后的发酵管，观察发酵液的颜色为黄色者记录为 产酸，杜氏小管内有气泡者记录为产气。将产酸产气和产 酸的两类发酵管分别划线接种于伊红美兰培养基上，在 37℃恒温箱中培养18~24h。挑选深紫黑色和紫黑色带有 37℃恒温箱中培养18~24h。挑选深紫黑色和紫黑色带有 或不带有金属光泽的菌落、或淡紫红色和中心色较深的距 离，将其一部分分别取样进行涂片和革兰氏染色观察

3.经镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，者将它的另一 3.经镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，者将它的另一 部分接种于装有倒置杜氏小管的乳糖蛋白胨培养 液的复发酵管中，每管接种菌落1~3个， 37℃ 液的复发酵管中，每管接种菌落1~3个， 37℃培 养24h,有产酸产气者为大肠菌群，记为阳性管。 24h,有产酸产气者为大肠菌群，记为阳性管。 4根据3个梯度(10mL、1mL、0.1mL)的5支中 根据3个梯度(10mL、1mL、0.1mL)的5 出现阳性管数，查表细菌最可能数，再乘以100 出现阳性管数，查表细菌最可能数，再乘以100 换算成1L水样中的大肠菌群数。 换算成1L水样中的大肠菌群数。

五、注意事项1.认真配制不同类型的培养基 2.检测中应合理控制所加的水样量 3.在滤膜法中每片滤膜的菌落数以20~60个为 宜。多管发酵法中水样稀释比例要适宜。 4.挑选菌落时认真选择大肠菌群典型菌落。