代谢木糖生产乙醇的基因工程菌研究进展

食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES

代谢木糖生产乙醇的基因工程菌研究进展

洪解放　张敏华　刘　成　邹少兰　吴经才

(天津大学石油化工技术开发中心,天津,300072)

摘　要　木糖广泛存在于林业及农业废弃物中,木糖发酵生产乙醇是再生资源的有效利用。文中报道了近几年来在利用基因工程菌发酵木糖生产乙醇方面的研究进展。重点介绍了大肠杆菌、酿酒酵母、树干毕赤酵母及运动发酵单胞菌的基因改造情况。

关键词　木糖发酵,半纤维素,乙醇,基因工程

　　20世纪以来人们利用石油作为主要能源和化工

原料,为人类社会的发展做出了巨大贡献。但由于大量开采,消耗过快,石油储备日趋减少,现已面临枯竭的地步。因此,略性问题。

1t,素、,其中半纤维素约占30%。,纤维素、半纤维素和木质素是世界上最广泛的可再生性生物资源。木质纤维素广泛存在于林业及农业废弃物中,利用酸解或酶解的方法将木质纤维素转化为还原性糖会产生大量的五碳糖(D2木糖和L2阿拉伯糖)和六碳糖(葡萄糖、半乳糖和甘露糖),其中六碳糖约占2/3,五碳糖约占1/3。而在半纤维素的水解产物中,D2木糖约占90%。

燃料乙醇是一种清洁便捷的可再生能源,是来自可再生资源中最有发展前景的液体燃料,被纳入许多国家的发展战略规划。木质纤维素水解产物中的六碳糖可由传统酿酒酵母很容易地发酵成酒精,而五碳糖则不能由传统酿酒酵母发酵产生乙醇。因此,如果能找到一种可以混合糖为原料产乙醇的工程菌,理论上可使乙醇产量提高25%,从而降低生产成本。

现有的产醇发酵菌种中有些虽然具有较强的产醇能力,但可利用碳源范围窄(如运动发酵单胞菌只能以葡萄糖、蔗糖或果糖作为发酵原料;酿酒酵母亦只能利用六碳糖,不能利用五碳糖);有些虽然可利用碳源范围较广(如大肠杆菌可同时利用五碳糖和六碳糖),但产醇能力极为有限。为解决以上问题,人们利用基因工程手段来改造现有微生物,以获得既能利用木质纤维素水解液中的多种组分又能稳定高效产醇

第一作者:硕士研究生。

收稿时间:2004-10-25,改回时间:2004-12-06

的基因工程菌。

1,。思路包括2方面:一是将五碳糖代谢途径引入只能代谢六碳糖的高效产乙醇菌种中;二是将高效产乙醇关键酶引入能代谢混合糖但乙醇产量较低的菌种中。用于本领域研究的宿主菌株主要集中在Escherichia

coli、Saccharomycescerevisiae、Zymomonasmobilis和Pichiastipitis等,另外还有一些典型的重组菌株。

111　Escherichiacoli

E1coli是目前基因工程中研究最广泛和最深入

的模式菌株,发酵底物广泛,所需营养简单,但其生长要求pH接近中性且范围较窄(pH610～810)。对E1

coli进行基因改造的主要出发点是使之能够适应纤

维素水解液,并控制其细胞内的碳代谢向生成乙醇的方向进行。

E1coli含有利用木糖的所有必需酶,但厌氧条

件下发酵形成的产物很复杂,而乙醇只是其中很少的一部分。最后生成乙醇的阶段是由丙酮酸脱羧酶(Pyruvatedecarboxylase,PDC)和乙醇脱氢酶Ⅱ(Al2

)催化完成的,E1colicoholdehydrogenaseⅡ,ADHⅡ

缺乏PDC,而且ADHⅡ的水平较低。Ingram等[1]从

Zymomonasmobilis中克隆到adhⅡ和pdc基因,放

在大肠杆菌lac启动子下,重组体称作PET(produc2

tionofethanol)操纵子,使用一个质粒作为载体转化至大肠杆菌中,得到的重组菌几乎专一地发酵产生乙醇。Ingram及其合作者又选择了几个大肠杆菌菌株作为宿主细胞,筛选的标准主要是对苛刻生长条件的耐受性(如乙醇耐受性)、质粒在非选择培养基中的稳定性及发酵木糖产生乙醇的高效性。得到的ATCC11303(pLOI297)菌株最适木糖发酵条件为

　114

综述与专题评论

42℃、pH610,最高乙醇耐受浓度高达53～56g/L,平

均生产速度达到0172g/L h(木糖浓度80g/L)[2]。Ingram领导的研究小组继续对大肠杆菌进行改造,将PET操纵子插入丙酮酸甲酸裂解酶基因(Pyru2vateformatelyasegene,pfl),并引入氯霉素抗性标记,转化至大肠杆菌中,筛选重组菌并进一步筛选高浓度氯霉素抗性菌株,得到的菌株最后在乙醛平板上进一步筛选,得到了一株乙醇高产菌KO11。该菌株能发酵木糖和葡萄糖产生乙醇,产量能达到理论值的103%～106%(丰富培养基中的非糖类发酵对该产量有部分贡献)。利用microarray技术比较KO11菌株和亲本ATCC11303全基因的表达情况,发现前者木糖代谢基因过表达[3]。Yomano等[4]用含乙醇的培养基对KO11进行筛选,使菌株耐乙醇能力达10%左右。Ingram实验室最近对抑制因子能力FBR,得FBR5。其乙醇产率达到0146～0151g/g,发酵时间36～60h。最近又构建了一些磷酸烯醇式丙酮酸2葡萄糖磷酸转移酶缺陷型(ptsG-)菌株,这些菌株能同时利用阿拉伯糖、葡萄糖和木糖来生产乙醇。但由于ptsG缺陷,葡萄糖转运能力不高,因此,在葡萄糖培养基中,这些缺陷型菌株生长较为缓慢[5]。

112　Saccharomycescerevisiae

酿酒酵母是工业上生产乙醇的优良菌株,与细菌相比具有较高的乙醇耐受力,对纤维素水解液中的抑制物有较高的抗性。但酿酒酵母缺乏木糖转化为木酮糖所需的酶,因而不能利用木糖,但它能利用木酮糖。为在酿酒酵母中引入转化木糖形成木酮糖的代谢途径,然后进一步代谢木酮糖产生乙醇,可以采取以下2种策略:一是在酿酒酵母中克隆并表达天然利用木糖真菌的2个基因,即木糖还原酶基因xyl1和木糖醇脱氢酶基因xyl2;二是在酿酒酵母中克隆并表达细菌的木糖异构酶基因xylA。目前也有用原生质体融合技术进行属间融合,得到能发酵木糖产生乙醇的酵母菌融合子的报道。11211　表达xyl1和xyl2酿酒酵母工程菌

xyl1和xyl2可从P1stipitis中克隆得到,它们在酿酒酵母中均能得到较高的酶活表达。重组菌能在木糖为唯一碳源的培养基上生长,但不能发酵木糖产生乙醇,消耗的少量木糖主要被还原为木糖醇及其

他副产物[6]。推测是木糖转化成乙醇整个代谢途径中的其他环节有阻碍。转酮酶(Transketolase,Tkl1)和转醛酶(Transaldolase,Tal1)是PPP途径中的关键酶,酿酒酵母中含有这2种酶,但酶活较低。实验发现这2种酶的活性表达高低影响重组菌发酵木糖产生乙醇的能力。鲍晓明等[7]以E1coli2S1cerevisiae穿梭质粒YEp24为骨架,将PichiastipitisCBS6054的xyl1及xyl2分别以不同的相对表达方向置于酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅰ(ADH1)启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子下,构建不同的xyl1及xyl2重组质粒,并在重组菌株中引入和基因,使酵母,,xyl1/xyl2比值为106,发酵产物中检测不到木糖醇,其他副产物也有所下降,而乙醇收率有所提高。汪天虹等[8]采用双载体系统,将携带有瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的表达质粒pAJ4012xdh1转化已带有树干毕赤酵母木糖还原酶基因的重组酿酒酵母H475,构建出重组酿酒酵母HX1。摇瓶发酵表明,该菌株对木糖的利用率达到9117%(118%木糖)～9615%(118%木糖+012%葡萄糖),乙醇生成量达到019g/L～0177g/L。Ho等[9]构建的S1cerevisiae重组菌株包含Psxyl1、Psxyl2和来自Saccharomyces的xks1(xy2lulokinasegene),该菌株表现出很强的发酵葡萄糖和木糖的能力。有报道[10]称木酮糖激酶(XK)的活性

和氧气的有无在重组酵母发酵木糖生产乙醇工艺过程中有重要影响。11212　表达细菌XI基因的酿酒酵母工程菌

木糖转化为木酮糖的另一途径是通过细菌的木糖异构酶,该酶一步即可完成木糖向木酮糖的转化,并且不需要任何辅助因子。xylA曾先后从E1coli、

Actinoplanes

missouriensis、Bacillus

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