15病毒感染的实验室诊断

病毒感染的实验室诊断

病毒感染的实验室诊断

病毒感染的实验室诊断

病毒感染的实验诊断方法

病原学诊断 病毒分离培养 显微镜检查 抗原检测 核酸检测

血清学诊断 抗体检测 IgM、IgG

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一、标本采集与运送(一)标本采集 采集时间：尽早采集(越早越好) 标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择

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(二)标本的运送与保存1.低温送检 4℃可保存数小时 -70℃可长期保存 -10 ~ -20℃下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本 对冷冻标本应避免反复冻融

2.保湿送检 50%甘油盐水保存送检 病毒转运培养基(virus transport medium ,VTM)含0.5%明 胶或牛血清白蛋白的Hank’s液

3.无菌送检 抑制细菌生长 100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素 抑制真菌生长 2.5μ g/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉菌素

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二、病毒的分离与鉴定(一)病毒分离和鉴定的一般程序标本采集 标本处理后接种

动物接种 观察发病 抗原检测 抗体检测 病理检查

组织培养 CPE EM包涵体 空斑试验 红细胞吸附 中和试验

鸡胚接种 卵黄囊膜 尿囊液 羊膜腔液 绒毛尿囊膜 观察囊膜病变 血凝试验 血凝抑制试验

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(二)病毒的分离 组织培养 鸡胚培养 动物接种

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1.组织培养

将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控制的 条件下使其生长繁殖的一种技术。 组织培养的类型 (1)组织块培养 (2)器官培养 毒 人胚气管-呼吸道病毒；人胚肠-肠道病

(3)细胞培养 最常用– 原代和次代细胞培养 – 二倍体细胞培养 – 传代细胞培养

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原代和次代培养细胞动物新鲜组织(人胚肾等)→胰酶消化→营养液培养→ 单层细胞(原代细胞) 原代细胞→胰酶消化→转种培养(次代培养细胞) 对病毒敏感，但制备费时费力，只能传2~3代。

二倍体细胞株 原代细胞反复传代(50~70代)仍保持二 倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。 传代细胞系 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体细胞，能在 体外无限增殖。增殖快，不易衰老，易于传代保存。常用 于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。

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2. 鸡胚培养常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养 接种途径及方法 新鲜受精卵38~39℃ 7~13d

卵黄囊接种 羊膜腔接种 接种病毒 尿囊腔接种

绒毛尿囊膜接种

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绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤

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常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病对 动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。 接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：

3. 动物接种

乙型脑炎病毒及狂犬病毒 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 乙肝病毒 流感病毒 黑猩猩静脉注射 鼻腔滴

种

小鼠脑内接种

用途

分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清

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(三)病毒的鉴定病毒的初步鉴定 动物感染范围及潜伏期 对鸡胚的敏感性 在细胞培养中的表现 理化性质的测定 最后鉴定 血清学鉴定: 中和试验、补体结合试验、血凝抑制 试验等 分离的新病毒，必须进行系统的鉴定

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病毒在细胞培养中的表现(1)细胞代谢作用改变(培养液颜色变化) 正常细胞代谢： 培养液由红变黄 病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红

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(2)细胞病变效应(cytopathic effect ,CPE) 病毒在细胞内增殖后，使宿主的形态发

生不同程度改变，这种由病毒增殖引起的细胞形态变化，称为细胞病变效应。 细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核 浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。

某些病毒感染细胞后不出现CPE

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(3)空斑现象

空斑(plaque)是指在单层细胞中，由活细胞包围的由病毒感染引起的死细胞的区域。一个空斑由一个病毒颗粒 感染 所致，利用空斑可纯化病毒。

不同种类病毒形成 的空斑大小和形状不同，可用于鉴定病毒。