微生物实验方案

自来水中大肠菌群的检测

一、实验目的

(1)了解和学习大肠菌群的测定原理和测定意义。 (2)学习和掌握用稀释培养法测定水中细菌总数的方法。 (3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。

二、实验原理

大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并能在乳糖培养基中，经37℃24~48h培养能产酸产气。我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。 二培养基的成分及制法： ①乳糖胆盐蛋白胨培养基：

蛋白胨20g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。

制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。

双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。 ②伊红美蓝琼脂培养基：

蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP04 2g， 2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。

制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。 ③乳糖发酵管：

除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。

器材：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等

三．实验步骤 1.检样稀释：

以无菌操作将检样25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌塑料烧杯中，经充分振摇成1：10均匀稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的 试管中，振摇成1：100稀释液。重复以上的操作，使成1：1000稀释液。 2.乳糖胆盐发酵试验

根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择二个稀释度，每一稀释度接种3管，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管。1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐

发酵管。然后置于36±1 ℃培养箱内，培养24±2hr，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则可按以下程序进行。 3.分离培养

将产气的发酵管分别接种于伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养24hr后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色。

4.革兰氏染色的方法

A取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂.B.涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上

片上，使其薄而均匀。C晾干：让涂片在空气中自然干燥。D固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。E染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min.F水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态.G媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗.H脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。I复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。革兰氏染色结束。

5证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色同时接种乳糖发酵管，置于36±1℃温箱内培养24±2hr，观察产气情况。乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。（凡是在乳糖胆盐发酵管产酸、产气，在指示性培养基上能生长的，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，在复发酵管中产酸、产气的，即说明有大肠菌群的细菌存在—大肠菌群阳性；有一项不符的，即说明无大肠菌群的细菌存在—大肠菌群阴性。若伊红美兰琼脂培养皿上显示为深紫色，具有金属光泽的菌落；或者是紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；再或者是淡紫色，中心色较深的菌落。就说明大肠菌群为可以菌落了。）

6报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)大肠菌群的最可能数。

图5-1 大肠菌群的检验程序

大肠菌群最可能数（MPN）检索表

1 1 1 1 1 1 1 1

2 2 2 2 3 3 3 3

0 1 2 3 0 1 2 3

110 150 200 240 160 200 240 290

3 3 3 3 3 3 3 3

2 2 2 2 3 3 3 3

0 1 2 3 0 1 2 3

930 1500 2100 2900 2400 4600 11000 >24000