基因工程(跨课程)综合实验讲义_百替生物

附件一：

基因工程（跨课程）综合实验讲义

基因工程 发酵工艺原理 生物技术药物药剂与药动学

广东药学院

生命科学与生物制药学院

2006年6月

（非正式出版物，请勿外传）

目 录

一、实验安排日程表.......................................１

二、目的和意义........................................... 2

三、课程介绍和课堂讨论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３

四、实验实施．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．７

五、实验考核．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．８

六、附录．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 9 附录一：讲义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 9 附录二：知识竞赛规则及试题．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 28

一、实验安排日程表

二、目的和意义

基因工程技术是生物学、医学、制药学以及相关专业最重要的课程之一，特别是对于生物制药专业的学生来说，基因工程技术是他们学习的核心内容之一，在本科阶段培养他们对这门课程的兴趣，使他们掌握基因工程基本的操作技能和方法，熟悉基因工程的操作流程，并对他们的动手能力和科学思维进行锻炼，对于他们今后的工作和进一步的学习具有非常重要的意义。本院是一个院所合一的单位，为了发挥以科研促教学的优势，同时为了使学生对基因工程在制药专业上的应用有一个更加全面的认识，我们选取了自己一部分的科研工作用于学生的基因工程综合性实验，其中涵盖了核酸类基因工程药物和蛋白多肽类基因工程药物的关键技术。本次综合实验按照从上游到下游的顺序分为数个单元，主要包括分子生物学技术、细胞生物学技术、实验动物技术、药剂与药代动力学技术以及蛋白发酵技术等。

三、课程介绍及课堂讨论

第一部分：基因工程介绍

一、基因工程技术概述

基因工程制药：利用基因工程的手段生产药物。

70年代基因工程诞生，1977年出现第一个重组的生长激素抑制因子，1982年基因重组产品——人胰岛素在美国问世，自20世纪80年代以来，仅美国、日本开发的生物新技术新药物便达200多种，大都是重组蛋白质药物和重组DNA药物。 美国是现代生物技术的发源地，也是应用现代生物技术研制新型药物的第一个国家，多种新型药物首创于美国。现有的近1300多家生物制药技术公司，资本总额已超过400亿美元。

基因工程药物大体分为：蛋白类药物（酶、细胞因子、激素、单抗等）、核酸类药物（基因治疗）

基因工程制药的特点：方便、快捷、可工业化生产

二、基因工程制药的流程

1、核酸类基因工程制药的流程

获得目的基因→插入载体→导入表达宿主→诱导表达→提取纯化目的蛋白→检测活性→动物实验→临床试验。

2、蛋白多肽类基因工程制药的流程

获得目的基因→插入载体→扩增后提取纯化质粒→导入特定细胞→检测活性→动物实验→临床实验。

3、两者异同点

测活：方法不一样，但目的一样。

工艺：核酸药的制备一般来说较简单，

给药方式：核酸药的给药方式较复杂

三、基因工程技术中一些关键的技术

核酸提取和纯化、逆转录、PCR、重组载体的构建、转化/转染、诱导表达、蛋白提取和纯化

四、基因工程技术需要注意的一些问题

1、目的基因的获取

2、载体的选择原则

3、表达系统的选用原则

4、活性检测的方式方法

五、与本次实验有关的实验内容介绍

1、结合科研工作介绍当初的选题背景和研究思路

肿瘤一直是困扰人类的一类重大疾病，对它的治疗一直是医生和科学家们重点研究的目标之一。研究发现，机体内发挥主要抗肿瘤作用的细胞是淋巴细胞，淋巴细胞通过体液免疫和细胞免疫两种方式发挥抗肿瘤作用，一般认为其中细胞免疫发挥着主要的抗肿瘤作用。目前寻找肿瘤特异抗原的工作进展不是很顺利，给肿瘤的诊断、治疗和研究其发病机理带来了很大的困难。我们从TCR负责识别抗原这一理论基础出发，应用基因优势取用方法，利用不同的肿瘤细胞刺激T细胞，检测TCR家族的表达谱变化，从而初步确定特异性识别不同肿瘤抗原的TCR分子家族，

在我们的研究中发现，肿瘤患者的TCR Vβ基因表达均有不同程度的减弱，即优势表达一个或少数几个TCR Vβ亚家族，同时其它TCR Vβ亚家族显著减少或完全缺如，即有受体偏移现象。如图：

我们将与肝癌识别有关的可变区属于Vβ7家族的TCR基因转入淋巴细胞，然后将该种淋巴细胞同肝癌细胞共孵育，发现该TCR分子不仅具有识别肝癌细

胞的作用，还有激活T细胞并增强其杀伤能力的功能，如图：

体内实验也显示转染了该TCR分子的淋巴细胞能够有效杀伤接种于SCID小鼠体内的人肝癌细胞。如图：

肿瘤组织大体照片

A对照组 B单纯PBMC组 C TCR转基因组

TCR基因转染组HE染色，20× TCR基因转染组LCA染色，

20×

HE染色和免疫组化显示淋巴细胞浸润

2、本次实验所要操作的具体内容介绍

结合大家以前的基础，本次综合性实验主要包括以下主要内容：

（1）核酸类基因工程药物部分

a、 提取和纯化携带Vβ7.1家族TCR基因的重组质粒；

b、将纯化的质粒转染人淋巴细胞，然后利用流式细胞仪检测所转基因的表达

情况；

c、 分别利用流式细胞仪和MTT法检测转基因淋巴细胞对肝癌细胞的体外杀

伤情况；

d、构建荷人肝癌细胞瘤昆明小鼠模型（考虑到学生人数较多和饲养条件的限

制，用昆明小鼠代替SCID鼠）；

e、 将转基因淋巴细胞注射至荷瘤小鼠体内的癌旁组织，并检测其在荷瘤小鼠

体内的分布；

f、 利用免疫组化检测所转TCR基因在小鼠体内的分布（因时间所限，将以

前所做结果利用多媒体形式向学生展示、讲解）。

（2）蛋白多肽类基因工程药物部分

考虑到以前学生已经进行过基因扩增、重组、转化和克隆等相关实验，本次就以摸索发酵条件为主要内容，包括：

a、 起始菌浓度及诱导时间对表达产物的影响；

b、培养温度对表达产物的影响；

c、 起始诱导pH值对表达产物的影响；

d、通气量对表达产物的影响；

e、 还原糖含量和补糖对表达产物的影响。

3、阐明本次实验所要达到的目的，帮助学生理解基因工程技术在制药上应用的。 第二部分：课堂提问与讨论

第三部分：学生复述自己对基因工程制药技术的理解

小结

四、实验实施

在实验实施的过程中，每个实验单元由一位主讲教师总体负责，每个单元的实验课开始前首先由主讲教师对实验原理、实验内容、操作要点等进行详细的讲解，点明需要特别注意的地方，并承上启下地点明本次实验在整个综合实验中的位置，这样的集体授课保证了学生知识的统一性。在实验的具体实施过程中，学 …… 此处隐藏：5762字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……