优质课血红蛋白的提取和分离

一、基础知识 1.分离生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物 理或化学性质的生物大分子。

2.蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和 大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质 和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种 类的蛋白质。

3、提取分离方法

凝胶色谱法 电泳法

(一) 凝胶色谱法(分配色谱法)

1.概念：根据蛋白质相对分子质量的大小分离蛋 白质的有效方法。

2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物(如葡聚糖或琼 脂糖)构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。

3.凝胶色谱法的原理①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对 分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道， 路程较长，移动速度较慢; ②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的 通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速 度较快。

③依据的特性是：蛋白质相对分子量的大小。

4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程

(二)缓冲溶液1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外界的 酸和碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混 合溶液。思考：说出人体血液中缓冲对。

H2CO3/NaHCO3

NaH2PO4/Na2HPO4

2.作用:能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响， 维持PH基本不变。

3.缓冲溶液的配制:通常由1-2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节 缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的 缓冲液。 磷酸缓冲液 4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ , 其目的是:

利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性)

(三) 电泳： 1.概念：

带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正 电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带 电荷相反的电极移动。 ③分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本 身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁 移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

二、实验操作(一)蛋白质提取和分离步骤 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 (二)操作过程 1.样品处理：

可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来 分离血红蛋白。

(1)红细胞的洗涤: ①目的: 去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化. ②操作： 1、采集血样 2、低速短时间离心(离心速度过高和时间过长，会使 白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果) 3、吸出血浆：上层透明的黄

色血浆。 4、生理盐水洗涤：下层暗红色的红细胞+五倍体积的 0.9%的NaCl溶液洗涤，搅拌10min 5、低速短时间离心： 6、重复3、4、5步骤三次 直至上清液中不再呈现黄色：红细胞洗涤干净(红 细胞洗涤干净的标志)。 洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。

(2)血红蛋白的释放： 加蒸馏水到原血液体积(使红细胞吸水胀破),加40%体积的甲苯 (溶解脂质物质，也有利 于红细胞的胀破和血红蛋白的释放) 臵于磁力搅拌器搅拌10min(加速红细胞破裂) 红细胞破裂，释放出血红蛋白

(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的 速度离心10 min。

②试管中溶液层次：第1层(最上层):甲苯层(无色透明); 第2层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体); 第3层(中下层):血红蛋白的水溶液层(红色透明液体); 第4层(最下层):其他杂质的暗红色沉淀层(暗红色)。 ③分离： 滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层， 分液漏斗中静臵：分出下层的红色透明液 体。

(4)透 析(粗分离):①过程： 取1ml的血红蛋白溶液装入透 析袋中，将透析袋放入盛有 300ml的20mmol/l的磷酸缓冲 液中(pH为7.0),透析12h

1mL

③原理：透析袋能使小分 子自由进出，而大分子保 留在袋内 ②目的： 除去样品中分子量较小的杂质 或用于更换样品的缓冲液。

20mmol/L磷酸缓冲液

2.凝胶色谱操作:(1)凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端磨平。 ②底塞的制作： 打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用 100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端(注意：导致液体残 留，蛋白质分离不彻底)。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位臵组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。

(2)凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择： A、材料：交联葡聚糖凝胶(G-75)。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨 胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理： 配成凝胶悬浮液： 计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中 充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

③凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装臵固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀

注意：1、装填时尽量紧密：以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅 乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果