T-DNA标签在植物基因克隆和功能分析中的应用

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西巍谴物学报，２００６，２６（５）：１０６６—１０７０

ＡｃｔｎＢｏｔ．Ｂｏｒｅａｌ．一Ｏｃｃｉｄｅｎｔ．Ｓｉｎ．

文章编号：１０００—４０２５（２００６）０５—１０６６—０５

Ｔ—ＤＮＡ标签在植物基因克隆和功能分析中的应用

侯雷平，李梅兰“

（山西农业大学园艺学院，山西太谷０３０８０１）

摘要：在植物功能基因组学的研究中，插入突变已成为迅速识别和研究标签基因的一个有效遗传工具。本文介绍

了Ｔ—ＤＮＡ标签的概念及应用前提，详细论述了Ｔ—ＤＮＡ标签在大规模植物基因功能分析中的应用以及使用启动子和增强子诱捕技术分离时空特异性启动子和表达基因，另外还分析了利用其特殊形式激活标签进行基因克隆和功能分析的优越性。并展望了Ｔ—ＤＮＡ标签的应用前景。关键词：植物；Ｔ—ＤＮＡ标签；突变体；基因克隆；功能分析中图分类号：Ｑ７８９

文献标识码：Ａ

ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＴ—ＤＮＡＴａｇｇｉｎｇｉｎＧｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇａｎｄ

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Ｔ～ＤＮＡ标签就是利用农杆菌介导的遗传转化方法将外源Ｔ—ＤＮＡ转入植物，以Ｔ～ＤＮＡ作为插入突变原或分子标记，来分离或克隆因为插入而失活的基因并研究基因功能的方法。由于Ｔ—ＤＮＡ左右边界及内部的基因结构是已知的，因此对获得的转基因插入突变体就可以通过已知的外源基因利用各种ＰＣＲ策略进行突变基因的克隆和序列分析，对比突变的表型进而研究基因的生理生化功能。这种方法已经成为反向遗传学研究的一种主要策略。

１

Ｔ—ＤＮＡ标签应用的前提

随着各种生物技术手段的使用及模式植物拟南

芥［１‘２］、水稻基因组计划［３“］的实施，许多植物的基因序列已经被测到，但有关基因功能的了解还远远落后于此，因此基因功能研究就成为一项艰巨而迫切的任务。

在植物的基因克隆和功能分析研究中，有许多种策略，利用突变体就是其中之一，但天然的突变体

收稿日期：２００５—１０－２２；修改稿收到日期：２００６０４—１７基金项目：中国博士后科学基金项目（２００４０３６５０４）

作者简介：侯雷平（１９６３一），男（汉族），副教授，从事蔬菜栽培生理及生物技术研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｏｕｌｅｉｐｉｎｇ一２＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ＊通讯联系人。Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｔｏ：Ｉ。ＩＭｅｉ—ｌａｎ．Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｍｅｉｌａｎ一２＠２６３．ｎｅｔ

万方数据　

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５期侯雷平，等：Ｔ—ＤＮＡ标签在植物基因克隆和功能分析中的应用

很少，且很难发现，所以常常采用各种物理、化学和生物技术的方法来人工诱导产生突变体。在生物技术方法中应用最多的是插入突变的策略口￣７］。插入突变就是将已知的ＤＮＡ片段插入到植物的基因组中，插入到基因组某基因座位的新基因会引起植物基因和染色体水平的重排，包括缺失、重复、倒位和易位等［８］，导致植物基因组内源基因的失活，破坏基因表达所需的完整性［９］，进而引起植株表现型上的差异，产生插入突变体。插入的ＤＮＡ还可以作为一种标记使得有关的基因分离变得快速方便，基因的功能分析也就变得相对简捷容易。因此利用插入突变源或者分子标记来分离和克隆由于插入而失活的基因并研究基因功能的方法已成为功能基因组学研究的一个有效工具［１…。

在植物中插入突变的方法有多种，最初采用的方法主要为转座子插入突变法［１１’１２］，利用这种方法进行基因克隆和功能分析虽然在许多植物中应用并获得成功［１３￣１５］，但转座子转座频率低，且插入的片段为多拷贝，这样在进行引起表型变异的插入片段的检测时就比较困难；另外有内源转座子的植物很少，这也限制了这种方法的使用。除转座子有插入致变的效应以外，植物农杆菌Ｔｉ质粒的Ｔ—ＤＮＡ也能随机且稳定地整合到植物基因组，引起植物基因的失活［１６３和染色体的重排［８’９３等，因此也可以作为突变原诱导植物产生突变［１７‘１８１；而已知的Ｔ—ＤＮＡ序列又可用于标记突变体植物的突变基因并进而了解基因的功能。因此Ｔ—ＤＮＡ标签法就成为研究植物基因功能的有效方法［１７Ｉ。

２

Ｔ—ＤＮＡ标签的具体应用

●

２．１大规模的植物基因功能分析

大规模的植物基因功能分析目前使用最多的是

插入突变的策略口”２１］。由于农杆菌介导的Ｔ—ＤＮＡ转化方法具有高效、重复性好、简便易行和表达稳定等优点［１８３，而且技术已经非常成熟，大多数植物都可以使用。此外Ｔ—ＤＮＡ插入随机［２２１，插入的位点可以贯穿整个基因组，甚至达到饱和，尤其像拟南芥这样的基因组很小的植物几乎可以标签到所有的基因。因此使用Ｔ—ＤＮＡ作为插入突变源进行突变体的筛选并进行基因功能的研究在许多植物中应用并取得成功瞳孔２４］。现在拟南芥已经有几个大规模的Ｔ—ＤＮＡ插入突变体库供人们进行研究，美国Ｓａｌｋ基因组分析实验中心的ＳａｌｋＴ—ＤＮＡ库就是其中之一。这些大规模的Ｔ—ＤＮＡ插入库为拟南芥基因功

万　

方数据能的进一步研究提供了有利的工具，许多实验室包括我们自己都在利用其中一些突变体进行基因功能及与已知基因之间互作的研究。

Ｆｅｌｄｍａｎ［１¨利用拟南芥种子感染转化法获得一系列植株高度异常的突变体，其中包括１株矮化突变体。该突变体高度为７～８ｃｍ，低于正常３０～４０ｃｍ的株高，子叶形状方形，叶片较短， …… 此处隐藏：15033字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……