实验五 玉米种子盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定

东北农业大学《种子检验学》实验课 实验五课件

实验五玉米种子盐溶蛋白聚丙烯酰 胺凝胶电泳鉴定

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目的要求

通过本实验，了解玉米种子盐溶蛋白的 提取方法、电泳程序、染色和鉴别方法。

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试液配制

凝胶溶液的配制贮备液A(分离胶贮备液) 贮备液B(分离胶缓冲液) 贮备液C(分离胶化学聚合催化剂1%APS) 贮备液D(浓缩胶贮备液) 贮备液E(浓缩胶缓冲液) 贮备液F(浓缩胶聚合催化剂1%过硫酸铵) 贮备液G(凝胶聚合加速剂) 四甲基乙二胺(缩写 TEMED)

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凝胶溶液的配制贮备液A(分离胶贮备液)

称取Acr90g和Bis3g,加入蒸馏水350ml,搅拌 至完全溶解(约30min),并定容至500ml 过滤入棕色瓶中，放入冰箱低温保存。

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凝胶溶液的配制贮备液B(分离胶缓冲液)

吸取含量88%的甲酸0.427ml 再称取甲酸钠(含2个结晶水)1.0456g 加入50ml蒸馏水，搅拌混匀，并定容到100ml, 并调节PH至3.2 倒入棕色瓶中，放入冰箱低温保存。

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凝胶溶液的配制贮备液C(分离胶化学聚合催化剂1%APS)

称取2gAPS,加入100ml蒸馏水，搅拌至完全 溶解 再定容至200ml,倒入棕色瓶中 放入冰箱低温保存，仅能保存1周。

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凝胶溶液的配制贮备液D(浓缩胶贮备液)

称取9.3gAcr和0.31gBis,加入蒸馏水30ml,搅 拌至完全溶解 并定容至50ml,倒入棕色瓶中 放入冰箱低温保存。

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凝胶溶液的配制贮备液E(浓缩胶缓冲液)

吸取含量为88%的甲酸0.218ml,称取甲酸钠 0.5228g,加入30ml蒸馏水溶解，并定容至 50ml 调节PH至5.6,倒入棕色瓶中 放入冰箱低温保存。 或者先溶解甲酸钠，然后用甲酸滴加，调节 PH至5.6。

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凝胶溶液的配制贮备液F(浓缩胶聚合催化剂1%过硫酸铵)

称取1gAPS,先用60-70ml蒸馏水溶解，搅拌 至完全溶解后

定容至100ml倒入棕色瓶中，放入冰箱低温保存。

仅能保存1周。

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凝胶溶液的配制贮备液G(凝胶聚合加速剂) 四甲基乙二胺(缩写TEMED)

吸取TEMED 1ml,加蒸馏水9ml 定容至10ml 放入冰箱低温保存。

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试液配制

样品提取液的配制电极缓冲液的配制 蛋白质染色液配制 凝胶贮备液配制

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样品提取液的配制

称取0.2928gNaCl,20g蔗糖和0.04g甲基绿，加蒸馏水溶解，充分搅拌至溶解

定容至100ml。

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电极缓冲液的配制

吸取含量为88%的甲酸溶液8.54ml,称取甘氨酸6.006g,先用1600ml蒸馏水溶解，最后定容 至2000ml

混匀并调节PH至3.45备用 可重复使用5次(或先将甘氨酸溶解，然后滴

加甲酸，调至PH3.45)

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蛋白质染色液配制

称取1g考马斯亮蓝R-250,先用95%酒精溶解至100ml, 再配10%三氯醋酸溶液

,然后吸取1%考马斯亮蓝 3.5ml,再加10%TCA100ml,配成一块凝胶板染色液。 或者将考马斯亮蓝R-250配成0.5%(W/V)的乙醇溶 液，用滤纸过滤，放入试剂瓶中备用。 另用蒸馏水配制10%(W/V)的三氯乙酸溶液。使用 时，取5ml考马斯亮蓝R-250的乙醇溶液，加到200ml 三氯乙酸溶液中，混匀 注：该染色液具有固定和染色两种功能，必须在放入 凝胶染色前再混合。

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操作技术

样品制备取单粒玉米种子，在单粒样品磨上粉碎后，收

集到1.5ml离心管中，按约1:1的量用洗瓶或滴管加入样品提取液，摇匀，自然沉降30min后， 取上清液即可。

一般加样30-50ul,如加的提取液太少则可补加。

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操作技术

凝胶制备电泳槽准备 先将玻璃装入橡胶封条中，然后插入有机玻璃制成的

电泳槽中，拧紧螺栓，固定好胶模。

注意：玻璃板必须洗干净，而且要干燥，手指不能接 触玻璃板表面，操作时用手拿住玻璃棱，另外，胶模 在电泳槽中要放平，位置合适，以防漏水。