病毒空斑纯化实验protocal

EV71空斑纯化实验protocal

原理

病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，接种的病毒液要充分分散和稀释。

流程

1.铺板

将已长满80~90%RDcell消化均匀铺于6孔板中。

2.病毒感染

细胞长成单层达80~90%吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度，并向每孔中加入200μL稀释好的病毒液（阴性对照加DMEM200μL），置于37℃温箱吸附两小时后弃残液。

3.制备2%琼脂糖

使用低熔点琼脂糖配方：0.2g加入10ml 无菌PBS中，121℃高压灭菌15min，取出后置于55℃水浴锅中待用

4.混合

将上述琼脂糖和2X？维持液(FBS浓度为2%）40~50℃水浴1:1混合后，加入培养板各孔，每孔2ml,室温放置30min以上使其冷却凝固成覆盖层

5.培养

把培养板倒置？，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h。

6.染色

制备含0.2%结晶紫(生理盐水稀释）的2%琼脂糖：双倍维持液（1：1），置于40~50℃水浴待用，吸取上述混合液加入培养板各孔，每孔2ml,使冷却凝固成第二覆盖层

7.培养

把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养48h观察，每皿蚀斑数量＜10个的稀释度中，挑选附近10mm均为健康的蚀斑。

8.将挑选的病毒至少再传2代