芽孢杆菌WY45产β-甘露聚糖酶发酵条件的优化

芽孢杆菌;β2甘露聚糖酶; 发酵; 魔芋粉

中国农业大学学报　2005,10(3):7780JournalofChinaAgriculturalUniversity

芽孢杆菌WY45产β-甘露聚糖酶发酵条件的优化

柴萍萍　韦　　江正强　李里特　日下部功

(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083)

摘　要　为获得最佳产酶配方,同时获得高活力的β2甘露聚糖酶,经碳源、氮源、碳氮质量比、初始pH和培养温度5个单因素发酵条件的优化,得到芽孢杆菌WY45发酵产β2甘露聚糖酶的最适发酵培养条件:以4g/L魔芋精粉为碳源,1133g/L大豆蛋白胨为氮源,碳氮质量比为4/1,初始pH515,50℃培养时间96h。此条件下β,2甘露聚糖酶活性最高可达2800U/mL。

关键词　芽孢杆菌;β2甘露聚糖酶;发酵;魔芋粉

中图分类号　TQ46418;O629　　　　文章编号　10074333(2005)03007704　　　　文献标识码　A

2mannanaseproductionbyBacillussubtilisWY45Optimizationofβ

ChaiPingping,WeiYun,JiangZhengqiang,LiLite,KusakabeIsao

(CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)

Abstract　BacillussubtilisWY45forhighactivityofextracellularβ2mannanasewasisolatedfromsoilsamples.Thefer2mentationconditions,includingcarbonsource,nitrogensource,ratioofthetwosources,cultivationtemperatureandpHvalue,wereoptimizedinordertoimprovetheactivityandamountoftheenzyme.TheresultshowedthatBacillussubtilisWY45grewbestwhenculturedat50℃withthemediumcomposedof4%konjacpowderascarbonsource,

1.33%soyapeptoneasnitrogensource,andpHvalue5.5.After96hculturing,theenzymeshowthehighestactivityof2800U/mLthatisthehighestvalueobtaineduptonow.

Keywords　Bacillussubtilis;β2mannanase;fermentation;konjacpowder

　　半纤维素是自然界第二大植物多糖资源,而甘

露聚糖作为半纤维素的第二大组分分布广泛,来源丰富[1],在魔芋粉、槐豆胶、沙蒿胶、瓜儿豆胶等中

β2甘露聚糖酶可以都有不同种类的甘露聚糖存在。

水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖等中的(1,4)2β2D甘露吡喃糖,主要产物为甘露低聚糖[2]。甘露低聚糖为功能糖类,不能被人体胃肠道消化,但可作为肠道益生菌———双歧杆菌的碳源,促进其增殖且抑制有害菌生长,从而改善人体肠道功能;同时,甘露低聚糖还有防龋齿的作用[35]。

对β2甘露聚糖酶的研究始于20世纪50年代末60年代初,是研究甘露聚糖及其水解时发现的;70

于对天然多糖类物质糖链结构的分析;80年代β2甘

露聚糖酶被作为微生物酶制剂开发,其研究开始向应用研究和产业化方向发展[49]。对β2甘露聚糖酶发酵的研究主要集中于黑曲霉菌(Aspergillus)和芽孢杆菌(Bacillus),而对芽孢杆菌的研究又多集中于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和嗜碱芽孢杆菌(alka2lophilicBacillussp.)。这3种芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌的发酵产酶活性最高,但目前所见报道中其活

2甘露聚糖性最大值也仅为33416U/mL[10]。由于β

酶活性水平普遍较低,限制了其在实际生产中的应用,为此,本研究对1株产较高活性β2甘露聚糖酶的芽孢杆菌的发酵条件进行优化,以期得到最佳产酶配方,同时获得高活力的β2甘露聚糖酶。

年代对产甘露聚糖酶的研究着重于产酶菌株的筛

选、酶的分离纯化和酶学性质,并将其作为工具酶用

收稿日期:20041220基金项目:国家“十五”科技攻关计划项目(2004BA713C0402)

作者简介:柴萍萍,硕士研究生;李里特,博士,教授,主要从事食品工程方面的研究,E2mail:llt@http://www.77cn.com.cn

芽孢杆菌;β2甘露聚糖酶; 发酵; 魔芋粉

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中国农业大学学报2005年第10卷

1　材料与方法

111　菌株与培养基

芽孢杆菌菌株WY45为本实验室从全国采集的200多份土壤样品中筛选得到的。发酵产酶培养基成分(质量浓度,g/L):槐豆胶15,牛肉蛋白胨8,酵母提取物4,KH2PO41,MgSO4 7H2O0125。112　主要试剂

槐豆胶(Sigma)、酵母提取物(Oxcid)、牛肉蛋白胨(北京奥星公司)、魔芋精粉(四川魔芋粉厂)、魔芋普通粉(四川魔芋粉厂)、琼脂粉(北京奥星公司),其他试剂均为国产分析纯。

β113　2甘露聚糖酶活性与蛋白质含量的测定β2甘露聚糖酶活性的测定参照DNS法[11],在019mL质量浓度为5g/L的槐豆胶底物(pH615,0105mol/L的磷酸缓冲液配制)中加入适当稀释的酶液011mL,60℃水浴中反应10min,用DNS试剂测定产生的还原糖量,以D2甘露糖作为标准。上述反应条件下,每min产生相当于1μmolD2甘露糖的还原糖所需要的酶物质的量为1个酶活性单位,U。蛋白质含量的测定采用Lowry法[12],以牛血清蛋白为标准。114　发酵产酶条件的优化

在250mL三角瓶中装入40mL发酵产酶培养基,在50℃恒温空气浴往复式摇床上以200r/min振荡培养。在此基础上进行以下不同试验。

1)碳源的影响。a1改变碳源(质量浓度15g/L)种类,考察其对产酶的影响。碳源包括单糖和多糖(槐豆胶、魔芋精粉、魔芋普通粉、花芋粉、瓜儿豆胶、脱脂椰粉、沙蒿粉、可溶性淀粉、马铃薯淀粉、葡萄糖和甘露单糖)共11种。b1最佳碳源确定后,将其作为唯一碳源并改变其质量浓度(10～50g/L,5g/L为1个梯度,共9个梯度),考察碳源不同质量浓度对产酶的影响。

2)氮源和碳氮质量比对产酶的影响。最佳碳源及其质量浓度确定后,用不同有机或无机氮源作为唯一氮源,质量浓度10g/L,考察氮源对产酶的影响。选用干酪素、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉蛋白

(NH4)2HPO4、胨、酵母提取物、麦芽提取物、NH4H2

(NH4)2SO4、PO4、KNO3、NH4Cl和尿素等12种氮源,并调节所有培养基初始pH使之与对照发酵产酶培养基相同。

最佳氮源确定后,改变氮源相对于碳源的添加

量,考察碳氮质量比对产酶的影响。碳氮质量比分别为1/1、2/1、3/1、4/1、5/1和6/1。

3)培养基初始pH的影响。在优化碳、氮源的基础上,以011mol/L的柠檬酸或NaOH溶液将培养基初始pH分别调至315、410、415、510、515、610、615、710、715和810。

4)培养温度的影响。在1)～3)的基础上,采用)发酵培养菌株,考察温度对产不同温度(30～55℃

酶的影响。

2　试验结果

211　不同碳源对酶活性的影响

不同碳源对WY45所产β2甘露聚糖酶活性的影响见表1。可以看出,魔芋精粉对其诱导产酶能力最强。以魔芋精粉为碳源的WY45所产β2甘露聚糖酶活性达1156U/mL,比以槐豆胶为碳源的高5倍以上;普通魔芋粉和花芋粉对WY45的诱导产酶效果也高于槐豆胶,但其诱导该菌所产β2甘露聚糖酶的最高酶活性与魔芋精粉诱导的相比要低300～500U/mL。槐豆胶和脱脂椰粉也可诱导该菌产酶,但酶活性低于500U/mL。其他碳源基本没有诱导产酶作用,甘露单糖对菌株的发酵产酶甚至起到了抑制作用。

表1　不同碳源对WY45产β2甘露聚糖酶活性的影响

Table1　Effectofcarbonsourcesonβ2mannanaseproduction

碳　源　槐豆胶魔芋精粉魔芋普通粉花芋粉脱脂椰粉

酶活性/

(U/mL)

2041156916651357

碳　源　瓜儿豆胶沙蒿粉马铃薯淀粉葡萄糖甘露单糖

酶活性/

(U/mL)4832343334

　　注:培养温度50℃,培养时间96h;下同。

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