CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性

CYP2C19基因多态性与丙 基因多态性与丙 戊酸血药浓度相关性研究答 辩 人：罗 静 指导教师：童卫杭 主管药师

厦门大学医学院本科毕业论文

主要内容

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研究背景 实验方法 实验结果 分析讨论

第一部分 研究背景传统的“标准化用药” 传统的“标准化用药”

一线抗癫 痫药( 痫药( AEDs) AEDs) 体内代谢 个体差异 大

药物耐受及 低药效 毒副作用及 不良反应

AEDs需合 AEDs需合 理的临床 个体化用 药

癫痫—— 癫痫——第二大神经系统顽症 ——第二大神经系统顽症

丙戊酸钠( VPA) 丙戊酸钠(Sodium Valproate, VPA)一线抗癫痫药， 一线抗癫痫药，目前仍无法取代 可用于多种类型的癫痫发作药代 动力 学( PK) PK) 复杂 ，个 体差 异大Ⅰ相线粒体内 β-氧化H 3C

H 3C OH O

图1.丙戊酸分子结构 Fig.1 molecular structure of valproic acid

未发现相关酶 的基因多态性 UGT酶基因的 UGT酶基因的 突变位点及突 变频率未知 CYP2C19中国人群 CYP2C19中国人群 突变率较高， 突变率较高，突变 位点研究成熟

体内 代谢 途径

Ⅱ相尿苷酸二磷酸 相关酶的 葡萄糖醛酸酶 基因多 (UGT)的酸化 的酸化 态性 细胞色素P450 P450酶 细胞色素P450酶 (CYP450)的代谢 (CYP450)的代谢

研究CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性具有临床研究价值 研究CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性具有临床研究价值 CYP2C19

CYP2C19最主要的两个突变位点 CYP2C19最主要的两个突变位点CYP2C19*2:第5外显子681位 G→A CYP2C19*2:第 外显子681位 681 CYP2C19*3:第 外显子636位 CYP2C19*3:第4外显子636位 G→A 636产生终止密码， 产生终止密码，过早终止蛋白合 产生无活性CYP2C19 CYP2C19酶 成，产生无活性CYP2C19酶，降 低对丙戊酸代谢

基因型鉴定：聚合酶链反应基因型鉴定：聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 分析(PCR-RFLP) 分析(PCR-RFLP)PCR:模拟体内DNA复制条件，体外酶促合成特异DNA片段的循环反 PCR:模拟体内DNA复制条件，体外酶促合成特异DNA片段的循环反 DNA复制条件 DNA 扩增目的DNA DNA。 应，以扩增目的DNA。 RFLP:某种限制性内切酶特异性识别位点，对DNA切割； RFLP:某种限制性内切酶特异性识别位点， DNA切割； 特异性识别位点 切割 基因突变时特异性酶切位点消失 不被限制性内切酶切断； 消失， 基因突变时特异性酶切位点消失，不被限制性内切酶切断； 电泳检测， 利用电泳检测 观察条带分析基因型。 利用电泳检测，观察条带分析基因型。 PCR-RFLP特点 操作简便， 特点： PCR-RFLP特点：操作简便，耗时耗费低 本实验中将采用准确度受公认的基因测序法验证该法的准确性 基因测序法验证该法的 本实验中将采

用准确度受公认的基因测序法验证该法的准确性

第二部分 实验方法一、数据收集2008年9月至2009年4月 第二炮兵总医院神经内科、神经外科门诊及住院部 服用丙戊酸钠的癫痫患者49例 筛选资料齐全的30例 记录性别、年龄、体重、治疗药物、治疗剂量、治疗药物血药浓度、 合并用药等情况。

血药浓度检测——荧光偏振免疫法(FIP) 荧光偏振免疫法( 二、血药浓度检测 荧光偏振免疫法 FIP)美国Abbott公司TDxFLx荧光偏振免疫测定仪及配套试剂盒服用丙戊酸至少5个半衰期(2-2.5天)后，血药浓度达稳态时，于 下次服药前，采抗凝静脉血4ml。 离心，取上清液(血浆)100μl,进样测定。

三、基因型鉴定1、提取DNA: 提取DNA: 北京QIAGEN公司血液基因组提取试剂盒提取所收集血样DNA

北京六一仪器厂DYY-II2型电泳仪和电泳槽DNA样品电泳检测 紫外灯下判读结果，照相存档

2、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) PCR反应 2.1 PCR反应 德国Eppendof公司PCR扩增仪设计并合成CYP2C19引物：CYP2C19*2:前引物F 后引物R CYP2C19*3:前引物F 后引物R 5’-AGCAGGTATAAGTCTAGGAAA-3’ 5’-ACAAATACGCAAGCAGTC-3’ 5’-ACTTTCATCCTGGGCTGTGC-3’ 5’ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3’

建立反应体系：蒸馏水9 μl 前引物0.5 μl,后引物0.5 μl HotStar Taq Master Mix 12.5 μl(包含4种dNTP,Mg2+,Taq DNA聚合酶， 以及Tris·Cl-KCl缓冲液) DNA 模板2.5 μl

PCR反应条件：CYP2C19*2:94℃预变性15min→94℃变性40s→51℃退火30s→72℃延伸30s 循环35次，最后72℃延伸10min。产物长度458bp CYP2C19*3:94℃预变性15min→94℃变性30s→56℃退火30s→72℃延伸30s 循环35次，最后72℃延伸10min。产物长度233bp。

PCR产物电泳检测 紫外灯下判读结果，目的条带清晰且无非特异扩增者进行下一步实验 照相存档

限制性长度多态性(RFLP) 2.2 限制性长度多态性(RFLP) 美国New England Biolabs公司内切酶SmaI 、 BamHI酶切反应：CYP2C19*2:用限制型内切酶SmaI30℃消化3h。SmaI酶切条件：PCR反应产物 10ul;水16ul;10×Buffer 2ul;SmaI 2ul。 CYP2C19*3:用限制型内切酶BamHI37℃消化3h。BamHI酶切条件：PCR反应产物 10ul;水18ul;10×Buffer BamHI 2ul;BamHI 1ul。

酶切产物电泳检测 紫外灯下判读结果，通过条带数目及位置，判断基因型 照相存档

3、基因测序取前引物6μl,与PCR产物同时送于测序公司分析基因序列

四、数据分析Spss 12.0 standard version(Spss Inc.) 用双侧t检验和χ2检验。P﹤0.05为差异有统计学意义

第三部分 实验结果一、病人一般情况和治疗情况男20例，女10例，男女比例2:1 平均年龄33.6±24.60岁，平均体重56.15±18.50kg 丙戊酸钠体重剂量范

围2.3-27.7mg/kg·d,平均值为11.74mg±6.10/kg·d 血药浓度范围7.97-89.96μg/ml,平均值为44.59±27.60g/ml

二、血药浓度监测情况测定血药浓度样品150例次 血药浓度有效范围：40-100μg/ml 低于有效浓度低限共65例次 超过有效浓度高限共2例次

三、全血基因组DNA提取与PCR扩增产物 全血基因组DNA提取与PCR扩增产物 DNA提取与PCR1、琼脂糖凝胶电泳显示，提取的基因组DNA条带结果 琼脂糖凝胶电泳显示，提取的基因组DNA条带结果 DNA目的条带 Marker

2000bp

图2.琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA Fig 2. Apparent DNA ladder shown by agarose gel electrophoresis

PCR扩增结果 2、CYP2C19*2、CYP2C19*3 PCR扩增结果 CYP2C19*2、CYP2C19*2 PCR产物长度458bpMarker 目的条带

500bp

458bp

图3.琼脂糖凝胶电泳检测CYP2C19*2PCR产物 Fig3. PCR amplification of CYP2C19*2 shown by agarose gel electrophoresis

CYP2C19*3 PCR产物长度233bpMarker 目的条带

250bp

233bp

图4.琼脂糖凝胶电泳检测CYP2C19*3PCR产物 Fig4.PCR amplification of CYP2C19*3 shown by agarose gel electrophresis

目的条带清晰，无非特异性扩增条带，说明PCR扩增较为 理想，符合研究要求。

四、基因型判定1、限制性片段长度多态性法CYP2C19*2突变位点：681G→A 当等位基因为681G时，SmaI酶将片断切开成为272bp和186bp两条片断 当等位基因为681A时，酶切位点消失，片段不被切开 据此分析酶切结果，判断基因型，见图5: GG基因型，也称野生型-272、186bp两条片断 GA基因型，也称突变杂合子-458、272、186bp三条片断 AA基因型，也称突变纯合子-458bp一条片断

Marker

500bp

458bp 272bp …… 此处隐藏：3308字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……