微生物限度检验标准操作规程(3)

10.4.4.2 镜检

铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。

10.4.5 氧化酶试验

取洁净滤纸片置于平皿中，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，若培养物不变色或仅显粉色为阴性。

若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。

10.4.6 绿脓菌素试验

取营养琼脂斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加三氯甲烷3-5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol／L盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳

性，否则为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。

10.5 若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应绻续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。

11 金黄色葡萄球菌

11.1 设备、仪器及用具

11.1.1 设备

微生物限度检测室室、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。

11.1.2 仪器及器皿

显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。

11.1.3 用具

大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。

11.2 试液、指示液

PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液、革兰染色液、碘液、95%乙醇。

11.3 培养基

营养肉汤培养基、卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基、营养琼脂培养基等。

11.4 操作方法

11.4.1 增菌培养

取营养肉汤培养基2瓶，每瓶各100ml，1瓶加入供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)，1瓶加入10ml的稀释液作阴性对照。30-350C培养18-24h，必要时可延至48h。阴性对照应无菌生长。

11.4.2 分离培养

取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平

板上，培养24-72小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于下表所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

11.4.3 纯培养

若平板上生长的菌落与表5所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2-3个菌落，分别接种与营养琼脂培养基斜面上，培养18-24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色、镜检。

11.4.4 革兰染色镜检

11.4.4.1 革兰染色

以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上,取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许,制成均匀涂片,自然或微温干燥,再通过火焰2～3次(载玻片不烫手)固定。滴加结晶紫染液,染色1min,水洗,滴加碘液,媒染1min,水洗,以滤纸吸干余水。滴加95%乙醇,脱色20～30s,水洗。滴加沙黄染液,复染1min,待干后,镜检。

11.4.4.2 镜检

金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌、无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈，单个，成对或成短链排列。

11.4.5 若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

12 梭菌

12.1 设备、仪器及用具

12.1.1 设备

微生物限度检测室室、净化工作台、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯、厌氧培养箱等。

12.1.2 仪器及器皿

显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。

12.1.3 用具

大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。

12.2 试液、指示液

PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液、3%过氧化氢试液、革兰染色液、碘液、95%乙醇。

12.3 培养基

硫乙醇酸盐流体培养基、梭菌增菌培养基、哥伦比亚琼脂培养基（含庆大霉素20mg/L和不含庆大霉素）

营养肉汤培养基、卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基、营养琼脂培养基等。 12.4 操作方法

12.4.1 增菌培养

取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml）2份，其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中，置厌氧条件下培养48小时。

12.4.2 增菌培养

取上述每一培养物0.2ml，分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养48-72小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选2-3个菌落分别进行革兰染色和过氧化酶试验。

12.4.3 革兰染色镜检

取疑似菌落涂片，作革兰染色、镜检，观察染色及菌体特征。培养后形成的芽孢，初呈“火柴头”状卵圆形，继而膨大呈球形，在菌体末端如鼓槌状。染色镜检有卵圆形至球形的芽孢，大于菌体，着生于菌体中央、次端或顶端。

12.4.4 过氧化酶试验

加一滴3%过氧化氢溶液至琼脂表面的单个分散的菌落，或转移至载玻片上的菌落上。有气泡产生，为过氧化酶试验阳性，梭菌成阴性结果。

12.5 结果判断

若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化酶试验阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。

13 白色念珠菌

13.1 设备、仪器及用具

13.1.1 设备

微生物限度检测室室、净化工作台、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯、生化培养箱（30-350C）等。

13.1.2 仪器及器皿

显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。

13.1.3 用具

大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。

13.2 试液、指示液

PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液、革兰染色液、碘液、95%乙醇。

13.3 培养基

沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、念珠菌显色培养基、1%聚山梨酯80-玉米粉琼脂培养基等。

13.4 操作方法

13.4.1 增菌培养

取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养48～72 小时。

13.4.2 增菌培养

取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24～48 小时（必要时延长至72 小时）。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。

若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。

如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培 …… 此处隐藏：2885字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……