微生物限度检验标准操作规程(2)

7.1.3 用具

大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。

7.2 试液指示液

PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液、靛基质试液、革兰染色液、碘液、95%乙醇。

7.3 培养基

胆盐乳糖培养基（BL）、4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸培养基（MUG）、曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）或麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基等。

7.4 操作方法

7.4.1 增菌培养

取胆盐乳糖培养基（BL）2瓶，每瓶各100ml，1瓶加入供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)，1瓶加入10ml的稀释液作阴性对照。30-35C培养18-24h，必要时可延至48h。0

阴性对照应无菌生长。

取上述培养物0.2ml，接种至5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳

性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。如MUG阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色），判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性（无荧光）、靛基质阴性（无色），判供试品未检出大肠埃希菌。

7.4.2 分离培养

7.4.2.1 如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1-2环培养液划线于曙红亚甲蓝琼脂（EMB）或麦康凯琼脂平板上，培养18-24h，观察EMB平板或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠埃希菌菌落生长。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于下表所列特征，可判供试品未检出大肠埃希菌。

大肠埃希菌菌落形态特征

7.4.2.2 若曙红亚甲蓝琼脂（EMB）或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表中所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、革兰染色、镜检及IMViC试验。

7.4.3 纯培养

如生长菌落与上表所列特征相符合或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18-24h，作以下检查。

如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EMB琼脂平板，培养18-24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。

7.4.4 革兰染色、镜检

7.4.4.1 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上,取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许,制成均匀涂片,自然或微温干燥,再通过火焰2～3次(载玻片不烫手)固定。滴加结晶紫染液,染色1min,水洗,滴加碘液,媒染1min,水洗,以滤纸吸干余水。滴加95%乙醇,脱色20～30s,水洗。滴加沙黄染液,复染1min,待干后,镜检。

7.4.4.2 染色结果 革兰阳性菌呈蓝紫色;革兰阴性菌呈红色,大肠埃希菌为革兰阴性短

杆菌,或球杆菌状,亦有杆菌状。

7.4.4.3 注意事项

7.4.4.3.1 玻片必须洁净，涂片菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。染色反应难于判断，菌细胞形态难于观察。

7.4.4.3.2 培养物的菌龄以16-24h为宜。培养时间过长的革兰阳性菌易染成红色。

7.4.4.3.3 脱色是关键，脱色时间不足，菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性。

7.5 结果判断

7.5.1 当阴性对照试验呈阴性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告检出大肠埃希菌。MUG阴性、靛基质阴性，报告供试品未检出大肠埃希菌。

7.5.2 MUG阳性、靛基质阴性、革兰阴性杆菌，报告供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阳性、革兰阴性杆菌，报告供试品检出大肠埃希菌。

7.5.3 供试品培养物检查不符合7.6.2二项中的任一项，报告供试品未检出大肠埃希菌。

7.5.4 当阴性对照有菌生长不能作出检验报告。

8 大肠菌群

8.1 设备、仪器及用具

8.1.1 设备

微生物限度检测室室、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。

8.1.2 仪器及器皿

显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。

8.1.3 用具

大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。

8.2 试液、指示液

PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液

8.3 培养基

乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）或麦康凯琼脂培养基等

8.4 操作方法

8.4.1 增菌培养

取含10ml的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1:10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、1:100的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml）、1:1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照。培养18～24小时。

加供试品的乳糖胆盐发酵培养基管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若乳糖胆盐发酵培养基管产酸产气，应进一步分离培养。

8.4.2 分离培养

将上述产酸产气的发酵管中的培养物，分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

若平板上无菌落生长，或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。

8.4.3 确证试验

从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24～48小时，若产酸产气，判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。

8.5.4 结果判断 根据大肠菌群的检出管数，按下表报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。

注：“+”代表检出大肠菌群；“-”代表未检出大肠菌群。

9 沙门菌

9.1 设备、仪器及用具

9.1.1 设备

微生物限度检测室室、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。

9.1.2 仪器及器皿

显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。

9.1.3 用具

大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。

9.2 试液、指示液

PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液

9.3 培养基

营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基、胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基、三糖铁琼脂培养基等。

9.4 操作方法

9.4.1 增菌培养

取营养肉汤培养基2瓶，每瓶各100ml，1瓶加入供试品10g或10ml)、，1瓶加入10ml的稀释液作阴性对照。30-350C培养18-24h。阴性对照应无菌生长。

9.4.2 分离培养

取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18-24小时后，分别划线接 …… 此处隐藏：3069字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……