高同型半胱氨酸血症对大鼠血脑屏障影响机制的实验研究(3)

查阅以往和最近的研究后发现：在脑血管疾病的发生发展过程中，血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)的受损是一个非常重要的病理环节[25]。BBB是一个复杂的紧密的细胞复合体，其主要由血管内皮细胞、血管内皮细胞之间的紧密连接、血管基底膜以及血管周围神经胶质细胞的终足等结构组成。BBB在保持中枢神经系统的结构和功能的正常以及维持中枢神经系统内环境稳定中起到至关重要的作用。缺血、缺氧、外伤、感染、免疫及理化因素如IL-1、TNF、5-羟色胺、缓激肽、活性氧等均可造成BBB结构的破坏，引起BBB通透性增高。新近Atul等[12]研究后发现：在胱硫醚合成酶缺乏的HHcy大鼠模型中，HHcy通过抑制脑血管内皮细胞之间的紧密连接蛋白occudin蛋白表达，使内皮细胞间紧密连接受到破裂损伤引起内皮细胞之间的缝隙增大，并在实验中检测到大鼠大脑皮质EB含量增加，提示HHcy可以通过某种机制来损伤血脑屏障，增加血脑屏障的通透性。

本实验我们按体重皮下注射蛋氨酸法建立了HHcy大鼠模型，由于高同型半胱氨酸血症形成需要一定的时间，所以造模第1 d血脑屏障正常。随着注射蛋氨酸时间的延长，模型组大鼠血浆Hcy浓度逐渐升高与对照组相比较有明显差异性，模型组脑组织中伊文思蓝含量也开始发生相应的变化；同时用透射电镜观察到模型组大鼠血脑屏

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文障结构也发生了相应的超微病理形态学改变。模型组大鼠第4 w血管基底膜连续性破坏、内皮细胞间的紧密连接破坏，而且血管周围有水肿；第8 w血管基底膜厚薄不均匀，内皮细胞间的紧密连接破坏更严重，基底膜厚薄不均匀更加明显。同时，在实验过程中我们发现一个现象：模型组大鼠脑组织伊文思蓝的含量先增高尔后又有所下降，考虑这种变化可能与脑血管自身修复有关，如果病变继续发展血脑屏障通透性可能变得更差，大鼠脑组织伊文思蓝的含量则可能再次升高。本实验的结果与Lee等[13]的研究结果相似，表明HHcy可以破坏血脑屏障的结构使其通透性增加。

HHcy对BBB结构和功能影响的机制目前尚不十分清楚，有研究认为[12]与兴奋性氨基酸毒性有关，推测脑和脑脊液中的Hcy可能与N-D-天门冬氨酸(NMDA)受体结合破坏神经细胞的DNA，或者触发血管周围胶质细胞死亡使包绕血管的胶质细胞终足消失。Agnati认为[11]：HHcy可通过诱导血管内皮细胞内钙离子浓度增高，从而损伤血管内皮细胞间的紧密连接。还有研究[13]显示由于内外环境的变化导致细胞基因转录水平的调节失衡，血管内皮细胞的紧密连接蛋白occudin表达增加，从而使血管内皮细胞的紧密连接破坏。新近更有研究认为HHcy激活血管壁以及脑组织中处于潜伏状态的基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases ,MMPs)，使基质金属蛋白酶过度活化，引起微血管内皮细胞的重塑内皮功能障碍，血管内皮细胞间连接受损，基底膜结构损伤，最终导致血脑屏障破坏[6]。因而，HHcy是如何引起BBB损伤的具体机制还不明确，有待于进行更深入细致的实验研究，以便为脑血管疾病的预防和治疗提供更多的临床方法和依据。

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文实验图片

图1 对照组/模型组第一天，血脑屏障正常；(TEM ×12 000)

图2 对照组第4周，血脑屏障改变不明显； (TEM ×12 000)

图3 对照组第8周，血脑屏障改变不明显； (TEM ×12 000)

图4 模型组第4周，基底膜厚薄不均匀而且在其周围有少许水肿形成，内皮细胞间的紧密连接破坏，缝隙增大； (TEM ×12 000)

图5 模型组第8周，基底膜厚薄不均匀更加明显，但周围无明显水肿，内皮细胞紧密连接破坏明显； (TEM ×12 000)

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文第二部分 MMP-2在HHcy致血脑屏障损伤中的

作用及联合维生素的干预效果

引 言

高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHcy)作为脑血管疾病的一个独立危险因素已经被大家所公认，其致病机制有多种，如氧化应激学说，平滑肌损伤学说内质网应激学说等等，然而目前其具体的机制并不明确。在脑血管病的发生发展过程中，血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的受损是一个非常重要的病理环节。近年来，有国外学者研究关注到高同型半胱氨酸血症与BBB的关系[12,25,28]。Atul等[29]通过实验研究发现：在胱硫醚合成酶缺乏的大鼠模型中检测到大鼠大脑皮质EB含量增加，提示高同型半胱氨酸血症使血脑屏障受到了破坏。Tyagi等[30]研究认为血脑屏障的受损可能与Hcy激活血管壁中处于潜伏状态的MMPs有关。基质金属蛋白酶（MMPs）是一组能降解所有细胞外基质成分的锌离子、钙离子依赖性结构高度同源的内肽酶家族、蛋白水解酶家族，基质金属蛋白酶在组织重塑、细胞迁移、血管生成、炎症及伤口愈合等各种生理病理过程中起关键作用。血管基底膜（extracellularmatrix，ECM）即细胞外基质，是正常血管壁的屏障，主要由血管内皮细胞和平滑肌细胞合成的不同类型的胶原蛋白和蛋白多糖以不同比例混合组成，是构成血脑屏障的重要组成部分。正常情况下血管壁的ECM保持完整，然而血管壁在受到有害刺激时可通过降解ECM多种成分导致ECM被破坏。

本课题第一部分已证实HHcy可导致血脑屏障破坏，但其具体机制尚不清楚。同时，我们已知叶酸、维生素B12和维生素B6是同型半胱氨酸代谢过程中重要的辅酶。那么，HHcy是通过怎样的途径引起血脑屏障破坏？基质金属蛋白酶是否参与此过程？补充联合维生素(叶酸、维生素B12和维生素B6)能否干预HHcy对血脑屏障的影响？为此，我们进行了第二部分的实验研究。

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文1 实验材料

1.1 实验动物：

健康雄性SD大鼠54只，体重200±20g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。大鼠随机分为三组：对照组、模型组和维生素组，每组18只。根据观测的不同时间点，每组大鼠再分为三个小组(1天组，4周组，8周组)，每小组各6只。

1.2 实验试剂：

DL-蛋氨酸、DEPC（焦碳酸二乙酯）购自Sigma公司，叶酸、维生素B12、维生素B6、琼脂糖凝胶购于武汉凌飞公司，异丙醇、氯仿、溴化已啶购于上海试剂一厂，Trizol Reagent (Gibcol公司)，逆转录酶（AMV-RT），Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR Marker购于华美公司，MMP-2引物和内参照GAPDH引物由上海生物工程公司合成。

1.3 实验仪器：

电子分析天平（德国Sartorius公司），低温超速离心机（BioRad公司），电泳仪及电泳槽（美国Amersham Pharmacia Biotech公司），PCR扩增仪（美国MJ Research公司），DZ-84恒温循环水浴箱（上海跃进医疗器械厂），紫外微量分光光度计（美国Amersham Pharmacia Biotech公司），凝胶成像和图像分析系统（日本Olympus公司），岛津LC-9A型高效液相色谱仪岛津（日本岛津公司），动物器械一套（协和医院神经内科实验室）。

2 实验方法

2.1 模型的制备：

模型组大鼠根据体重每日皮下注射用生理盐水配成的蛋氨酸80mg/(kg·day)溶液，对照组大鼠根据体重每日皮下注射相应体积的生理盐水。维生素组注射蛋氨酸同时注射0.5mg叶酸，2.5mg维生素B6和0.5mg维生素B12/（天·只）。分别在实验开始后的第1天，第4周和第8周处死各组中相对应小组的大鼠。

2.2 大鼠血浆Hcy测定：

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文各小组分别于实验后第1天，第4周和第8周断头处死后采血，采用高效液相色谱法检测各组大鼠血浆Hcy含量。

2.3 大鼠脑 …… 此处隐藏：3162字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……