高同型半胱氨酸血症对大鼠血脑屏障影响机制的实验研究(2)

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华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文前 言

脑血管病是危害人类健康的主要疾病之一，其逐次复发常常导致预后及生存质量每况愈下，给患者与家属带来极大痛苦。因此，尽可能了解脑血管疾病发生的危险因素和发病机制对我们预防和治疗脑血管疾病有巨大的帮助。

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是人体内的一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢过程中的重要中间产物，遗传、种族、疾病、年龄、饮食和药物等均有可能影响血浆Hcy的水平。在生理状态时，血浆Hcy浓度较低；在病理状态下，血浆Hcy水平显著地升高称为高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHcy)[1]。国内外大量的研究结果表明，HHcy是脑血管疾病的一个独立危险因素[2-3]。虽然HHcy已经被公认是脑血管病一个独立的危险因素，但是HHcy导致脑血管病发生的机理涉及到细胞分子水平的多个环节，至今仍不完全清楚。

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases ,MMPs）是一组能降解所有细胞外基质成分的锌离子、钙离子依赖性并且结构高度同源的内肽酶家族、蛋白水解酶家族。它们在胚胎发育、组织塑形、瘢痕改造和血管发生等生理过程中起着重要作用；在病理条件下，它们参与了炎症、肿瘤、创伤修复等病理过程。研究发现[4-5]，MMPs参与了中枢神经系统肿瘤、脑血管病、脑动脉瘤、脑动静脉畸形等各种不同病理生理过程。

脑血管疾病的发生很大程度上与血脑屏障破坏有关；血脑屏近几年研究[4-7]表明：

障在受到有害刺激时，血管内皮细胞和平滑肌细胞可分泌MMPs降解血管基底膜多种成分导致血脑屏障被破坏。同时，国外学者已关注到HHcy与血脑屏障破坏有非常密切的关系[8-10]，但是鲜见在体研究，国内也基本无相关报道。那么，能否通过在体研究来观察HHcy与血脑屏障的关系? MMPs是否在血脑屏障破坏过程中发挥作用? 为此，我们进行了下面的实验研究，欲通过本研究为脑血管病的发病机制拓展新的理论基础，并为其预防和治疗提供新的临床思路。

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文第一部分 高同型半胱氨酸血症对大鼠血脑屏障的影响

引 言

高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHcy)作为脑血管疾病的一个独立危险因素已被大家公认，其致病机制有多种学说，如氧化应激学说，平滑肌损伤学说，内质网应激学说等等，然而其确切的致病机制目前还不十分清楚。许多研究证实[6-8]，脑血管疾病、颅内感染，颅内肿瘤等与血脑屏障的损伤有密切关系。近年来，国外学者已关注到高同型半胱氨酸与血脑屏障的关系[6,7,12,13]，国内基本无相关报道。本实验部分采用按体重皮下注射蛋氨酸法建立高同型半胱氨酸血症大鼠模型。采用高效液相色谱法检测大鼠血浆Hcy含量；用比色法检测大鼠大脑伊文思蓝(EB)的含量来比较血脑屏障通透性的改变；用透射电镜直接观察血脑屏障超微形态学的改变。

1 实验材料

1.1 实验动物：

健康雄性SD大鼠36只，体重200±20g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。大鼠随机分为两组(1) 对照组 (2) 模型组，根据观测的不同时间点，每组大鼠再分为三个小组(1天组，4周组，8周组)，每小组各6只。

1.2 实验试剂：

DL-蛋氨酸（Sigma公司），伊文思兰（武汉凌飞公司），甲酰胺（武汉凌飞公司），1%锇酸、4%戊二醛溶液（同济医学院电镜室）。

1.3 实验仪器：

721分光光度计（上海光学仪器厂），电热恒温水浴箱（杭州蓝天化验仪器厂），岛津LC-9A型高效液相色谱仪岛津（日本岛津公司），动物器械一套（协和医院神经内科实验室），CM-120透射电镜（Phillip公司），BH-2显微镜（日本Olympus公司）。

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文2 实验方法

2.1 模型的制备：

模型组大鼠根据体重每日皮下注射用生理盐水配成的蛋氨酸80mg/(kg·day)溶液，对照组大鼠根据体重每日皮下注射相应体积的生理盐水。分别在实验开始后的第1天，第4周和第8周各处死模型组和对照组中相对应时间点的大鼠。

2.2 大鼠血浆Hcy测定：

各小组大鼠分别于实验后第1天，第4周和第8周断头处死后采血，采用高效液相色谱法检测大鼠血浆Hcy含量。

2.3 大鼠大脑伊文思蓝(EB)含量：

各组小组大鼠在处死前4h，通过腹腔缓慢注入2％伊文思蓝生理盐水液(每千克体重注射2ml)，4 h后迅速断头取脑，分开大脑半球后去除血凝块、蛛网膜及脑室脉络丛。捏取双侧大脑半球放置于已知体积的甲酰胺中，测量脑体积后继续加甲酰胺至脑体积的5倍，置37℃水浴48h然后使用分光光度计在波长632nm处测定光密度值。以甲酰胺作空白比色，根据标准曲线计算出EB含量(µg/mm3)。大鼠脑组织EB的实际含量为上述值的5倍。

2.4 大鼠血脑屏障超微结构：

在大鼠大脑额叶大致相同部位用锋利刀片取小块含微小血管的脑皮质组织，剪切成大小约1×1×1 mm3的标本，然后放置于4%戊二醛（PH=7.4）固定液中固定2h，接着取出后放入PBS（0.01M，PH=7.25-7.35）4℃下反复冲洗12 h以上，再经过1%锇酸固定2h后梯度酒精脱水，国产环氧618（环3618）树脂包埋，并在解剖显微镜下修整制成超薄切片，3%柠檬素+0.1%醋酸铀双重电子染色之后在光镜下准确定位，最后在透射电镜下观察血脑屏障超微结构并照相保存。

2.5 统计学方法：

采用SPSS13.0软件包进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示。同周不同组间的实验均数比较采用两独立样本t检验；同组不同周间的实验均数比较采用配对 t检验。检验水准取а=0.05，以P<0.05为具有统计学意义。

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文=

3.1 两组大鼠血浆Hcy水平变化： 3 实验结果 =

对照组血浆Hcy水平在各时间点无明显变化，模型组血浆Hcy水平随时间延长而升高，与对照组比较有显著性差异（P<0.05），见表1

表 1 两组大鼠血浆 Hcy水平变化 (±s)

血浆 Hcy水平(µmol/L)

组 别 1天(n6) 4周(n6) 8周(n=6)

对照组 模型组 12.24±1.15 12.14±1.16 12.46±1.17 ==12.26±1.12 23.60±1.57#△ 32.18±1.20#△

#P<0.05，与对照组比较；△P<0.05，与同组第一天比较

3.2 大鼠大脑伊文思蓝(EB)的含量：

EB含量如表2所示：模型组的EB含量在第4周和第8周与对照组比较有显著性差异（P<0.05），同时模型组第4周和第8周与同组第一天比较均有显著性差异（P<0.05）。

表 2 两组大鼠脑组织中伊文思蓝含量的比较 (±s)

脑组织中伊文思蓝含量(µg/mm3)

组 别

对照组 模型组 1天(n6) 4周(n6) 8周(n=6) 3.24±0.78 3.36±0.28 3.32±0.56 3.20±0.81 9.54±0.67#△ 6.67±0.54#△

#P<0.05，与对照组比较；△P<0.05，与同组第一天比较

3.3 大鼠血脑屏障超微结构：

因HHcy形成需要一定时间，所以模型组第1天与对照组第1天无差别，对照组各时间点血脑屏障无明显改变；模型组第4周时基底膜厚薄不均匀而且在其周围有少

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