用BRET方法研究活细胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事项(2)

“Measurement”标签左侧的“fluor label”

7. 在BRET试验方案中已经使用了COS-1细胞。然而，可以在任何细胞类型中进行的BRET也可以进行转染。各种转染试剂和技术可以应用于转染带有cDNA结构的细胞。在我们的手中，使用Polyfect 转染试剂（QIAGEN）可以获得一直的结果。然而，使用的转染试剂要随着选择的细胞类型而变化。

8. 在进行BRET试验时，Rluc比EYFP融合蛋白表达的水平重要。不同数量的Rluc 和 EYFP融合cDNA被传染和实验来决定获得最优化BRET信号的条件。融合蛋白的极限表达是不建议的。因

为这可能增加非特异性BRET信号，增强阴性对照如：其他的Rluc和EYFP标记蛋白和感兴趣蛋白在同一水平表达的风险。然而，某些相互作用（低亲和性相互作用）可能需要较高蛋白表达水平来检测。除了蛋白质表达的cDNA转染总数，供体对受体蛋白表达的比率也是很重要的，研究每种蛋白质相互作用的最优化比率需要通过经验来确定。通过滴定的EYFP融合蛋白表达量，同时又保持了Rluc融合表达常数, BRET50（使用荧光计测量EYFP融合蛋白表达，BRET值达到最大值的一半）可以确定为一个相互作用亲和力的相关性的近似措施。GPCRs在异源系统中的过量表达由于这些7TM高度的疏水性可能导致产生不真实的聚集和非特异性的BRET信号（10）。在受体表达的低水平或者在受体的生理水平以下进行 BRET,可能有助于防止非特异性BRET信号。但是，蛋白质相互作用可能在相对亲和力方面各有不同，因此为了检测相互作用的BRET信号指示要求不同水平的蛋白质表达和不同比率的供体的受体分子。

9. 能够检测BRET信号仪器的主要特点是具有连续的滤光片，然后在两个不同波长范围进行测量发射光。目前有几种多功能酶标仪可以做这个实验，但是由于光学系统的原因，他们的灵敏度收到很大限制。相反，Mithras是一款多通路光学系统的多功能酶标仪，可以提供测量BRET信号要求的灵敏度（图2，独立光路系统）我们和berthold公司在研发能够测量高灵敏BRET信号的96孔板多功能酶标仪上进行合作。由于遇到上述蛋白质极端表达的问题，因此使用低水平的蛋白质表达如：接近或者低于生理水平，进行BRET实验和检测BRET信号是很重要的。因此，非常期望仪器能有检测低BRET信号，来降低由于BRET融合蛋白高表达带来的非特异性BRET信号。

10. 在添加腔肠素到细胞悬浮液时，由于荧光素酶反应显示快速衰减的动力学。所以需要立即测量发射光。最理想的方法是通过仪器带的试剂注射器来注射腔肠素，

图3A：选择底物和处理的进样器的孔，第四个进样器允许添加多个期望的处理到不同的孔中

图4A：在选择注射孔以后，点击测量标签，双击左边的“dispense”来设置属

性

由于BRET信号在添加腔肠后需要几秒才能达到平衡，采取重复读取的所有样本。并且在添加底物后也要执行重复读取，随着时间的推移，可以监测相互作用的稳定性。在监测各种激动剂或者拮抗剂可能对受体-蛋白相互作用的影响的时是特别重要。通过执行重复读取，一个 BRET动力学分析正在执行，可以实现实时的监测相互作用。尽管随着时间的推移，发射光的实际数量在减少。阳性对照Rluc-EYFP BRET融合的BRET比率在添加腔肠后保持至少30分钟恒定，

总结：

BRET是一种新型的共振能量转移技术，它代表了一个检测和分析广泛的蛋白质相互作用的有力工具，与目前使用的方法相比具有显着优势。它代表了强大的，单一性的活细胞检测系统，它已经成功的应用于研究受体的相互作用，也非常适合于研究任何蛋白质和蛋白质之间的相互作用。

材料

· 黑色和白色Isoplate 96孔板（25块/包）Perkin Elmer 货号1450-581

· Mithras LB940 多功能酶标仪

· PBS Powder 10 x 1L Gibco（Invitrogen）货号21600-010

· 腔肠（h形式）250ug分子探针货号 C-6780

· EYF P载体-Clontech公司： pEYFP-C1 货号 6005-1，pEYFP-N1 货号6006-1

· Rluc载体-Promega公司：PRL-CMV 货号 E2261