高产果胶酶菌株的筛选鉴定及其发酵条件研究_陈勇强

第2期

2014年2月

第14卷

中国食品学报

JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology

Vol．14No．2Feb．2014

高产果胶酶菌株的筛选鉴定及其发酵条件研究

陈勇强

严

芬

叶秀云

李仁宽

陈冬梅

林

娟

*

（福州大学生物科学与工程学院

摘要

福州350116）

采用观察透明圈与液态发酵测酶活相结合的方法，从腐烂的水果中筛选获得1株果胶酶产生菌G1。通

过形态观察与18SrDNA序列分析，鉴定菌株G1为黑曲霉。对G1菌株的发酵工艺进行优化，确定最佳培养基配方（g/L）：桔皮粉32，麸皮10，（NH4）2SO422，Na2HPO4·12H2O8.4，KH2PO41.4，MgSO4·7H2O1.0，CaCl20.1，··FeSO47H2O0.1，ZnSO47H2O0.1，培养基初始pH6.5；最佳发酵条件是：装液量50mL/250mL，转速180r/min，接种量9%（体积分数），32℃培养7d。在此条件下，果胶酶活力达到270.4U/mL，比优化前提高了8.7倍。关键词文章编号

果胶酶；黑曲霉；筛选鉴定；发酵工艺

1009-7848（2014）02-0138-08

果胶酶（pectinase）是指能催化分解果胶质的

1

1.1

材料与方法

试验材料菌种

来源于果园土壤与腐烂水果。

果胶、半乳糖醛酸，购自Sigma

主要试剂

1类酶的总称，包括原果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、

果胶裂解酶和果胶酯酶等[1]。它在食品工业中应用非常广泛，如果汁澄清，提高果蔬出汁率，改善酒的色泽，增加酒的香气，提取生物活性功能成分，茶叶发酵的预处理等

[2-3]

1.1.1

1.1.2

公司；基因组DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、

。此外，果胶酶在饲料、环

250bpDNAmarker，购自TaKaRa公司；其余试剂

均为分析纯级。

保、纺织、发酵和洗涤等行业也有重要应用价值[4-6]。果胶酶主要来源于微生物的代谢产物，现已发现

1.1.3培养基

40多种微生物能产果胶酶，有曲霉属、青霉属、镰

孢属、克鲁维氏酵母以及某些兼性厌氧细菌等[7-9]。

利用微生物发酵生产果胶酶，因具有产能大、周期短、质量稳定、经济效益高等优点，故微生物是生产果胶酶的优良生物资源。我国是微生物资源大国，而目前国内生产的果胶酶酶活不理想，产量小，不能满足国内市场日益增长的需要。筛选果胶酶高产菌株及优化其发酵产酶的条件，是目前亟待研究和解决的问题。本文从自然界中筛选果胶酶高产菌株，并对其产酶培养基和发酵条件进行研究，以期为果胶酶的发酵生产打下基础。

1）富集培养基（g/L）：果胶2，（NH4）2SO43，Na2HPO4·12H2O4.2，KH2PO41.4，FeSO4·7H2O

·0.01，MgSO47H2O0.5，pH自然。

2）筛选培养基：在富集培养基基础上添加2%的琼脂。

3）查氏培养基[10]（g/L）：NaNO32，K2HPO41，

··KCl0.5，MgSO47H2O0.5，FeSO47H2O0.01，蔗糖

30，琼脂20，pH自然。

4）马铃薯培养基[10]（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20，pH自然。固体马铃薯培养基（PDA）加琼脂20g。

5）基础发酵培养基（g/L）：桔皮粉12，（NH4）2SO4

··10，Na2HPO412H2O8.4，KH2PO41.4，MgSO47H2O

1.0，CaCl20.1，FeSO4·7H2O0.1，ZnSO4·7H2O0.1，pH自然。

1.2试验方法

1.2.1产果胶酶菌种的筛选初筛：取10g采集

样品于90mL无菌生理盐水中振荡30min，制成

收稿日期：2013-02-24

基金资助：福建省自然科学基金项目（2011J01218）；福建

省教育厅科技项目（JA10022）

作者简介：陈勇强，男，1986年出生，硕士生通讯作者：林娟

第14卷第2期高产果胶酶菌株的筛选鉴定及其发酵条件研究139

悬液。取悬液1mL于富集培养基中30℃，200r/1.2.3.2菌株分子生物学鉴定以基因组DNA

min培养24h。对培养后的富集液进行梯度稀释，

涂布于筛选培养基中，30℃恒温培养3d，挑取单菌落进行纯化、保藏。同时用卢戈氏碘液对涂布培养后的筛选培养基进行染色，测量菌落直径与透明圈直径。挑选菌落直径与透明圈直径比值（HC比值）大的菌株进行复筛。

复筛：将初筛得到的HC比值较大的菌株接种于含50mL基础发酵培养基的250mL锥形瓶中发酵，30℃、180r/min摇床中培养3d。发酵液经4℃、8000r/min离心5min，取上清液作为粗酶液，测定其果胶酶活力，筛选出酶活力较高的菌株。

提取试剂盒提取的G1菌株基因组DNA为模板，利用18SrDNA通用引物[13]（上游引物：5′-

GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′；下游引物：5′-TC-CGCAGGTTCACCTACGGA-3′）进行PCR扩增G1

菌株的18SrDNA。将PCR扩增产物回收纯化后进行序列测定。测序结果拼接后利用Blast工具进行序列同源性分析，下载部分同源序列通过

ClustalX进行序列对位排列后，使用Mega5.05[14]软件以邻位相连（Neighbor-Joining）算法生成系统

发育进化树。系统树各分枝的置信度经重抽样法（Bootstrap）1000次重复检测。

1.2.4

果胶酶活力测定

采用DNS法测定，根据

产酶条件优化利用单因素试验优化培养

1.2.2基碳源、氮源、培养基初始pH、装液量、摇床转速、接种量以及培养温度。无特别说明，每个试验做3个平行，重复3次。优化前的发酵条件：装液量50

文献[11]进行适当修改。吸取1.5mL1%果胶溶液（用pH5.0柠檬酸缓冲液配制）加入25mL具塞比色管中，于50℃水浴预热3min后加入0.5mL适当稀释粗酶液，精确反应30min后加入2mL

mL/250mL，接种量5%，培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养3d。

DNS，沸水浴5min，定容25mL。在波长540nm处

测定吸光值，以灭活的酶液作为空白对照，每个样品平行测定3次，结果取平均值。果胶酶活力定义：在上述反应条件下，1mL酶液每小时水解底物生成1mg半乳糖醛酸的能力，定义为1个酶活力单位（U）。

2

2.1

结果与分析

果胶酶产生菌的筛选

经筛选培养基初筛获得8株霉菌（HC值大于

1.50），分别命名为G1~G8，它们能够较好地降解

果胶。对初筛获得的菌株进行发酵培养后测定其酶活力（表1）。菌株G1相对于其它菌株具有较高

1.2.3菌株鉴定

1.2.3.1菌株形态鉴定

依据《真菌鉴定手册》进

的酶活，培养3d后酶活力达到27.9U/mL。最终挑选菌株G1做研究。

行菌落特征和菌丝体形态特征的鉴定[12]。

表1

菌株编号

果胶酶产生菌的筛选结果

菌株编号

Table1Screeningresultsofpectinase-producingmicroorganismsHC比值1.651.781.651.70

酶活力/U·mL-1

HC比值1.811.941.511.63

酶活力/U·mL-1

G1G2G3G4

27.925.621.720.8

G5G6G7G8

26.022.316.319.2

2.2菌株G1鉴定

2.2.1形态鉴定菌株G1在PDA平板上生长迅速，生长初期菌丝呈白色，第2天后出现黑色孢子，菌落呈绒毛状，背面有放射状脊（图1）。在显

微镜下观察（图2），菌丝有横隔，多分枝，部分菌

丝细胞形成特化的足细胞；分生孢子梗的末端膨大，形成球状的顶囊，顶囊上着生有初生小梗和次生小梗，小梗上着生分生孢子；分生孢子呈球形，黑色，成串生长。初步鉴定菌株G1为曲霉属。

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