5 分子生物学研究方法(上)

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?现代分子生物学的快速发展 分子生物学研究方法，特别是基因操作技术和基因工程技术 的进步。

第五章(上)、第六章(下) 基因工程，也称为DNA重组技术---绪论

第五章 1 重组DNA技术回顾

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基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分，只不过 它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍 与性状表达。

分子生物学研究 的核心技术 核酸操作技术主要包括：核酸凝胶电泳、核酸 的提取与纯化、 PCR扩增、突变位点的检测、 DNA分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列 分析、核酸分子杂交以及基因的人工合成、定 点突变等。

第 五 章

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第五章：分子生物学研究方法(上)1 重组DNA技术回顾(由于实验

安排问题，先讲第二节)2 主要核酸操作技术

第十一章 基因组与比较基因组学3 蛋白质组和蛋白质组学技术

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核酸分离 核酸凝胶电泳技术

2 主要核酸操作技术

mRNA的纯化和文库的构建 PCR技术 突变位点的检测 基因克隆技术

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2.1 核酸分离 --前言 核酸(nucleic acid)是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。

无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。

核酸样品质量将直接关系到实验的成败。

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2.1 核酸分离一、核酸分离原则

(一)保持核酸分子一级结构的完整性(二)防止核酸的生物降解 二、核酸提取的方法 三、分离提取核酸的主要步骤 (一)细胞的破碎 (二)核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 (三)核酸的沉淀 四、核酸的浓度测定 五、核酸的保存

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2.1 核酸分离一、核酸分离原则(一)保持核酸分子一级结构的完整性

温度不要过高； 控制一定的pH值范围(pH值5-9);

保持一定的离子强度; 减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。

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2.1 核酸分离一、核酸分离原则

(一)保持核酸分子一级结构的完整性(二)防止核酸的生物降解 二、核酸提取的方法 三、分离提取核酸的主要步骤 (一)细胞的破碎 (二)核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 (三)核酸的沉淀 四、核酸的浓度测定 五、核酸的保存

Molecular Biology Course 2.1 核酸分离

一、核酸分离原则(二)防止核酸的生物降解

细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键， 破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。1 DNA酶抑制剂

金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离

子Mg2+、Ca2+的激活，使用其螯合剂可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2;

阴离子型表面活性剂：如 SDS对核酸酶有抑制作用，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合 物高盐溶液中沉淀。

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一、核酸分离原则(二)防止核酸的生物降解 2、RNA酶(RNAase)

RNAase分布广泛，极易污染样品，且耐高温、耐酸、耐碱， 不宜失活。DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。

作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。

使用注意：剧毒；DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大 100~ 1000 倍；容易降解， 保存在4 ℃或液氮中；提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。

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一、核酸分离原则

2、RNA酶(RNAase) 1) 所有的玻璃器皿-使用前180℃的高温下干烤6h或更长时间。 2) 塑料器皿用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻 璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用) 3) 有机玻璃电泳槽等，先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干 燥，再浸泡在3% H2O2室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗， 晾干。 4) 配制的溶液应用0.1% DEPC,37℃处理12h以上，然后高压 灭菌除去残留的 DEPC ;不能高压灭菌的试剂，用 DEPC 处理 水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 5) 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，手套要勤换。 6) 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

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2.1 核酸分离一、核酸分离原则

(一)保持核酸分子一级结构的完整性(二)防止核酸的生物降解 二、核酸提取的方法 三、分离提取核酸的主要步骤 (一)细胞的破碎 (二)核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 (三)核酸的沉淀 四、核酸的浓度测定 五、核酸的保存

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核酸提取方法 异硫氰酸胍-酚-仿抽提法 碱裂解法 溴化十六烷基三甲铵(CATB)抽提法 溴化乙锭-氯化铯(EtBr-CsCl)梯度离心法 寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(Oligo(dT))-纤维素 层析法 等。

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2.1 核酸分离一、核酸分离原则

(一)保持核酸分子一级结构的完整性(二)防止核酸的生物降解 二、核酸提取的方法 三、分离提取核酸的主要步骤 (一)细胞的破碎 (二)核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 (三)核酸的沉淀 四、核酸的浓度测定 五、核酸的保存

Molecular Biology Course 2.1 核酸分离

三、分离提取核酸的主要步骤(一)细胞的破碎 1 高速组织捣碎机捣碎 2 玻璃匀浆器匀浆

3 超声波处理法4 液氮研磨法 5 化学处理法(SDS、LDS,吐温80等) 6 生化法(溶菌酶、

纤维素酶等)

Molecular Biology Course 2.1 核酸分离

三、分离提取核酸的主要步骤(二)核蛋白的解聚、变性蛋白的去除1、SDS(十二烷基磺酸钠) 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解 膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 2、蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的 组蛋白； 3、机溶剂酚与氯仿： 抽提掉蛋白质和其它细胞组份。

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(三)核酸的沉淀有机沉淀剂

(1)乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影 响以后实验。

缺点：需要量大(2:1),一般要求低温操作。

(2)异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。 一般不需低温长时间放置。 缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀.异丙醇难以挥发除去。所

以，最后用70%乙醇漂洗数次。

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实验X 总RNA的提取 提取方法：

异硫氰酸胍-苯酚抽提法、Trizol试剂 Trizol提取总RNA (了解) 取50-100 mg组织样加入液氮预冷过的研卜中，研磨，并根 据情况及时补加液氮(样品体积不能大于Trizol的1/10); 组织样研磨充分后，将组织样转移至1.5 ml离心管中，加入 1ml Trizol,冰上放置5 min使核蛋白复合物完全溶解； 加入0.2 ml氯仿，盖上盖子用力摇动15 s,室温放置2~3 min,4 ℃ 12 000 rpm 离心10 min;

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实验X 总RNA的提取 转移上清至一新管，再加入0.2 ml氯仿，盖上盖子用力摇 动15 s,室温放置2~3 min,4 ℃ 12 000 rpm 离心10 min; 转移上清至一新管，加0.5 ml的异丙醇，混匀，室温放置 10 min,4 ℃,8 000 rpm离心15 min; 用75%乙醇(用0.01%DEPC处理水配置)洗涤沉淀2次， 4℃,7 500 rpm离心5min; 将沉淀稍干燥后(不要晾的太干，否则很难溶解),溶于 30μl的0.01%DEPC处理水中。