蜘蛛基因组DNA Cosmid文库构建

动物学报

4 ( )7 3~7 7 0 1 7 6:1 1,2 0

A ca Zo lg c nia t oo ia Si c

蜘蛛基因组 D A C s d文库构建 N omi和拖丝蛋白基因的克隆李敏(建师范大学生物工程学院 .州 300 )福福 5 0 7

Da i vd L. Ka l n pa(物技术中心， u大学，马萨诸塞州 0 15美国 )生 T 25 .

美 t词蜘蛛

基因组文库

拖丝丝蛋白基因

蜘蛛拖丝是已知性能最好的天然纤维 ( pa Ka[ n e a,1 9;Me oe a . 9 4。与其它结构蛋 tl 94 l t 1,1 9 ) l 白，胶原蛋白和弹性蛋白相似，丝蛋白具有自装如配性质，通过二级结构调节，以提供机械支撑。和其它台成高分子比较，如聚酯，的柔韧性和弹性丝使得它能经得起重压和疲劳。而且，丝膜表现出很好的透明性、生物可降解性和水一空气界面的通透性。研究证实，棒络新妇蛛 ( p i vps Nehl aa ie ) a的拖丝是所研究的各种类型的丝中，功能指标最优的 ( r8 e a . 9 1 u nf t a . 9 5。 Kek m t 1,1 9:C n i e 1,1 9 ) f

丝蛋白基因。由于目前对拖丝丝蛋白基因结构与功能的研究工作均来自其 3端部分 c N序列，隆 D A克的丝蛋白基因代表的只是拖丝蛋白基因完整长度的一

部分，重组表达产物与天然纤维在分子构型上只

具有一定程度的相似性。为获得人工合成完整的拖丝蛋白，迫切需要弄清楚丝蛋白全基因结构。本文以 N c v e蛛肌肉组织为材料，拟通过构建 l i s蜘 a p

蜘蛛基因组 DN omi A C s d文库，据已知的拖丝丝根蛋白部分 e NA序列，合成寡核苷酸探针，筛选、 D克隆出天然拖丝丝蛋白基因。

因拖丝的特殊性质，其作为生物材料应用在医学上表现出极大的潜力，如作为缝台材料、细胞膜以及组织工程所需的临时搭架等。 天然拖丝丝蛋白的分子量尚未确定 .几篇文献报道分别为 2 5k 7 D,3 4 k和 70 k ( t 2 D 4 D Meo ln. 94 Z,1 9:C n ea a d ls a . 9 1 ak o ta . 1,1 8;J c sn e 1 .

1材料和方法I 1材料 .

N lvps蜘蛛由美国 T f ca ie ut学 K pa s大 a ln教授提供。S p r o omi u eC s1C s d载体、包装蛋白 Gg— ia pc akⅢ一 L和宿主菌 XL Bu X - leMR购自 Srtg n。 t ae e a地高辛一1d T"端加尾试剂盒、碱性磷酸酶 l -A P 3-末偶联羊抗地高辛 F b片段、化学荧光底物试剂 34 a __ 甲氧基螺甾{,2二氧六环一 2 ( . )三环 1一 3 5氯 [ .. .’ 3 3 1 1]癸基 l一.基磷酸钠 ( s D) 4苯 c P、封闭试剂和尼龙膜 (径 1 2 mm)购自 B e r g r直 3 oh i e n Ma n e n hi m。T N连接酶、小牛肠碱性磷酸酶、 4 A D 各种限制性内切酶、质粒 D A快速抽提试剂盒和 N D NA分子量标准购自P o e a rm g。寡核苷酸序列见文献 ( cda o o a . 9 8,Ol o 1 5 gg c— Arii n c 1,1 9 ) i : tc g gg c a g g t t a a g a ga a g

19 ) 9 5。对丝蛋白水解分析，证实丝蛋白主要是由两个最小的氨基酸——甘氨酸和丙氨酸高度重复组成，重复分别达到 4%和 2%,其它残基为谷氨 2 5酸、丝氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸。 对拖丝丝蛋白基因结构与功能的研究工作主要在其部分 c NA序列 ( u a . 9 0 ima t D X 1,1 9;H n ne.,

19;G eet e a . 9 6,这些 c NA部 92 urt t 1,19 ) e D

分序列具有相似的 3-序列。人工合成寡核苷酸"端序列和部分 c A序列在原核系统表达也有报道 DN( r c ta,1 9;Le s a . 9 6 P i ee l n 95 wi 1,1 9;Arii— cda

c n a . 1 9 ) oc 1, 9 8。由于拖丝丝蛋白基因高度的重复性和高 G+ c含量，迄今尚未克隆出完整的拖20一 .0收稿 .2 0—42 00叭 1 0 10 8修回*福建省自然科学基金重大科技项目 ( 0 1 0 6 No2 0 F0 )

(5 7~ 1 0 b 3 ) Ol o 2 5 1 2 p 、 i : gga g c a g g t g a ca g tcg

3

第一作者蕾开李皱 .女， 4岁，士，授。研究方向：基因结构与功能。En:ml@… a 4博教 . I i i 2 n

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4 7卷

( 2 5 I1 0~ II 0 b 7 p 3 )和 Ol o 3:5 tg c a c i g cg a ag— c ccg tg tg c acg tac a c ca g ( I5 5 a ta ac tg t ata ttta g ctg t 3 5 8~

f[ l 0 f l l mo/ l . mo/ t mo ,1 mo,2 f lg,0 4 f l t,0. 8 l O

f lt系列稀释地高辛标记的寡核苷酸撵针和对 mo h l照标准物，别加 1分 到尼龙膜，10固定 3 2℃ 0 an ri。洗膜液 ( 0 mo/马来酸，10 mmo/ 1 0 m lL 5 lL N C,p ., 3 T e 0 a I H 7 5 0.% wen2 )洗涤 2mi,膜 n将置于封闭液 (%封闭试剂，1 0mmo/ 1 0 lL马来酸，

1 3 p3 )由美国 Tut 5b 6 f s大学医学院合成。各

种化学试剂购自 Sg 1公司。 i a n1 2方法 .

12 1蜘蛛基因组 D omi .. NAC s d文库的构建1 2 1 1高分子量 D . .. NA的提取及部分酶解 Ig 新鲜的蜘蛛腹部肌肉组织置于液氮，粉碎，DN A提取方法见分子克隆手册 (a r k e a. S mbc t 1, o 18 ) 9 9,采用蛋白酶 K和酚/氯仿法，纯化的 D A N经 0 3琼脂糖凝胶电泳鉴定为高分子量 DN .% A( 5~2 0k )取 l 1 0 0 b。 O旭基因组 D NA, S u3 I a A 部分酶解至 DN分子量在 3~ 4 b之间，回收 A 5 5k

10mmo/ C, H 7 5,温 3 n 5 lLNa I p . )室 Omi。然后在

含碱性磷酸酶偶联的羊抗地高辛 F b片段 (: a 1 50 0 0 )的封闭液中，室温 1h 。洗膜液洗膜两次，

每次 1 n 5mi。膜在检测液 (0 10mmo/ r—cl lLT iH, s10mmo/ 0 lLNa I p .)中平衡 2mi,稀释 C, H 95 n加

的 C P

(:0 S D 1 10稀释于检测液 )覆盖于膜上 5 a n 3℃ ri. 7温育 3 n X光片曝光。 0mi, 1 2 2 3菌落原位杂交、DN . . A斑点杂交和 S uh o t— en分子杂交菌落吸附于尼龙膜，变性、固定， r 杂交反应，D NA少量快速提取，限制酶消化等方

片段，去磷酸化等见分子克隆手册。 1 2 1 2 S pra 1C s d载体制备、连接和包 . . . u eos omi 装 1 g u ec s o mi 0 s p r o 1C s d载体经 X a I消化后， b 去磷酸化，B mH消化，回收 6 7k a I . b片段。部分酶解的外源 D NA与载体按 1 8比例连接，连接：物 1 加入到从一8℃取出刚融化的包装提取~4 O物 Gi p c 1 XL I,混匀，室温 2h g ak 1 a I -I 。加入 5 0 0

法参见分子克隆手册。但在菌落原位杂交中，增加了固定后的滤膜加 2mg ml白酶 K在 3℃温育 /蛋 7 1h 。此外，杂交反应缓冲液组分吉 5 S×S C,0 1 .% N十二烷基甲基甘氨酸， .2 D,1 0 0%S s%封闭剂。 地高辛标记探针加入量为 2 mo/杂交液。杂 0p l ml交反应温度的选择，依据公式 T是 1埘=8 .—1 . 15 66lN+0 4 ( C%一 ( 0/ )(为链长 )决 g a .1 G 4 ) - 60 N N

S缓冲液和 2 l HC 3 M O u C L,离心，取上清液， 贮于 4。℃

1 2 1 3测定基因组 DN omi .. . A C s d文库滴度

大

肠杆菌 XLBu— l MR在 1 l B,1 o/ — e Om L 0 mm lL Mg

定的，交温度低于 T O。在本实验中，杂交杂 1℃温度为 6℃。杂交反应后检测方法同前。 0

S, .%麦芽糖中生长 4 O 0 10, O4 0 2~5h( < . )30 orri o/ n离心 1 a 0mi。混悬菌体细胞于 5ml 0 n 1

mmo/ S,部分菌液以 1 o/ S 4 lLMg04取 0mm lLMg O稀释至 01 0 .,分别与用 S缓冲液以 1 1￣0=0 5 M:0

2结

果

2 1构建蜘蛛基因组 D A C s d文库 . N omi用识别四核苷酸序列的限制酶 S u A I对

高 a 3分子量 …… 此处隐藏：11814字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……