illumina基因测序仪中文测序原理

illumina基因测序仪中文测序原理

Sequencing Technology

张军磊 13655172180南京才泰生物科技有限公司

© 2010 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminaDx, Solexa, Making Sense Out of Life, Oligator, Sentrix, GoldenGate, GoldenGate Indexing, DASL, BeadArray, Array of Arrays, Infinium, BeadXpress, VeraCode, IntelliHyb, iSelect, CSPro, GenomeStudio, Genetic Energy, HiSeq, and HiScan are registered trademarks or trademarks of Illumina, Inc. All other br ands and names contained herein are the property of their respective owners.

illumina基因测序仪中文测序原理

测序流程1文库制备 (~ 6 hrs)片段化的DNA末端修饰/添加一个A

两端加接头选择加上接头的 DNA扩增达到合适上样量

2自动簇生成 (~ 5 hrs)1-8个样品

杂交到 flow cell表面延伸oligo接头

完成桥式扩在模板序列链上加测序引物

3测序(~ 36 hrs for 36循环)1-8样品对模板序列链执行测序

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

illumina基因测序仪中文测序原理

文库制备流程纯化基因组 DNA

使DNA片段化片段< 800 bp

DNA片段通过填充和核酸外切酶作用使末端补平磷酸化作用

末端修饰末端补平，在5’加上一个磷酸基团

加上一个“A”到3’端3’–小突出添加一个A碱基连上接头

在末端加上接头加上接头的DNA片段

片段大小选择300– 600 bp片段

PCR扩增扩增带接头的DNA

文库质控基因组DNA文库制备完成3COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

illumina基因测序仪中文测序原理

测序流程1 Library prep (~ 6 hrs)DNA片段末端修饰/添加一个A DNA片段两端加接头选择加上接头的DNA片度

2 Automated Cluster Generation (~ 5 hrs)1-8个样品

杂交到 flow cell表面延伸杂交的oligo短序列进行桥式扩增

3 Sequencing (~ 46 hrs for 36 cycles)1-8个样品对forward strand执行测序

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

illumina基因测序仪中文测序原理

流动槽(Flow cell)

8个通道

简易流程中的关键点

Flow cell表面结合一层oligo接头。

纯净的簇是在一个独立的环境中生成的(需要一个洁净的室)测序步骤也在flow cell的簇上进行

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

6

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成: DNA片段杂交&延伸接头序列

> 50 M的单分子 DNA片段杂交到 flow cell表面的 oligo引物上。单分子DNA片段杂交在flow cell表面后， oligo引物就会在聚合酶作用下延伸。

Oligo引物

3’延伸

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

7

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成:变性双链DNA

双链分子变性分开。模板链被洗掉。新合成链以共价键的形式紧紧连接在flow cell表面。原始链

新合成链

洗掉

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

8

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成:在flow cell上形成共价结合的单链DNA片段

单链被以共价键的形式结合随机到 flow cell上的模式。

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

9

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成:桥式扩增单链弯曲杂交在相邻的 oligo引物上形成一个桥式结构。杂交引物在聚合酶作用下延

伸。

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

10

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成:桥式扩增

形成双链的桥式结构.

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

11

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成:桥式扩增

双链的桥式结构变性打开 Result:形成2个copy的以共价键结合在flow cell的单链模板。

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

12

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成:桥式扩增单链弯曲杂交在相邻的oligo引物上形成一个桥式结构。

杂交oligo引物在聚合酶作用下延伸。

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

13

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成:桥式扩增桥式扩增一直循环重复，直至形成5000-10000 copies

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

14

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成双链DNA桥变性分开。

Reverse strands被剪切然后洗掉。

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

15

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成…仅仅留下由forward strands

组成的簇。

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

16

illumina基因测序仪中文测序原理

簇生成游离的3ˋ端被封闭，防止不必要的DNA延伸。

COMPANY CONFIDENTIAL– INTERNAL USE ONLY

17