灵芝原生质体再生和诱变菌株的培养特性及多糖的研究

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芝

(中国农业大学食品学院，京 10 9)北 004

张

(中国医学科学院药用植物研究所 )

uV诱变后所获菌株的生物学特性，尤其是在固体和液体培养过程中的生长特性，以便确定这些菌株的优劣。本文在灵芝经原生质体制备再生及诱变所得菌株初步选择的基础上，认为与原菌株相比形态变化挑选较大的 2 4个菌株进行平板及液体培养特性研究，为

质特编生 体性 蔡

为了较系统考查灵芝经原生质体制备再生及

1 3 1多糖提取 ..

发酵液多糖提取

将 2个菌株的发酵液分别各 4

取 l0 l加 9乙醇 60 l使乙醇终浓度达到 5m, 5 0m 8,加乙醇边搅拌， 0边静置 2h以上，多糖沉淀， 4使 过滤，沉淀用热蒸馏水溶解成为多糖溶液，用将采 Svg法脱蛋白 3 ea~5次至无蛋白层为止，再次醇沉， 离心去上清液，沉淀部分干燥后即为多糖。 菌丝体多糖提取将已烘干的菌丝体称重后，粉碎，别加入一定量的蒸馏水在 9℃左右的水溶中分 0提取 2次，次 2,每 h提取液合并后加入 9乙醇使醇 5含量达 8, 0以下步骤同提取发酵液多糖一致。1 3 2多糖的含量测定 ..

再及 下一步应用其中优良菌株提供科学依据。灵芝多糖是和糖分菌株进行了多糖含量测定，为下一步应用研究提供科学可靠的优良菌株。 1 11材料 .

灵芝生多 一，了从其多糖的含量评价灵芝的有效成分之为原生质体再生及诱变菌株的优劣，本文对所获得的部

诱的材料与方法变研

1 1 1茵种来源 . .一

究 郭生质体再生菌株中挑选从原

1 2

个菌株： GR一2、 9 GR— l一 l、—6 GR、 4 GR一2、 6 7 GR

3、 3GR一3。星体诱变菌株中选 1 2个菌株： 的 5从原生质

株

GI 4 G1 7— 1、一 1— 1 GI 2、— 2一、— 0 GI

7 9、一 4 G1 8—

3。出发菌株 (。 0 G)

培

1 12培养基组成 .. 1 13仪器 ..

养

(与前文同)

S—C循环水式多用真空泵；5 HZ 71

取脱去蛋白的多糖，照文献[,]参 1 2方法用 6 lLH I mo/ C水解，中和后， 35一二硝基水杨酸比用，色定糖法测样品中总糖含量。 2结果与讨论 2 1从灵芝原生质体再生和诱变再生的 6菌珠 . 7个中，初步筛选认为生长特性有较大变化的 2经 4个菌株挑选出来，行较系统的生物学特性观察研究，进主要考查在平板上及液体发酵时的特点，从表 l中可以看出，些菌株，这不论在平皿或液体培养时，生长状况

型分光光度计 玎。

12培养特性研究 .固体平皿培养分别挑取上述原生质体再生及诱变菌株至麦麸斜面培养基上，4恒温培养 7将 2' C d,斜面菌种接种至麦麸平板培养基的中央部位，同法培养 1d用+.c打孔器在菌落表面打孔，菌片大 0。 08m使小一致。分别取 l菌片转接至含 2ml 0麦麸培养基新平皿中央， 1菌种重复 4,4C下培养 1d测量每皿 2￣ 0,菌落大小及菌落形态变化。 液体摇瓶培养：传代次数和培养时间均相同的将平皿菌种用斗 c打孔器在菌落表面打孔，别将 o 8m分大小一致的菌片接种至 10/5ml角瓶麦麸液 5ml20三体培养基中， l片/,菌株重复 4瓶，4瓶每 2床转 C摇速 10/ n振荡培养 ld观测摇瓶中菌丝体生长 4rmi, 2,状况。

发生了较大变化，在平皿中主要表现在生长速度、气生菌丝是否发达及色素分泌等；液体培养时，主要表现在菌丝结球及菌丝体生长量方面。 22从表 2可以看出， .与原始菌株 (相比，芝原 G)灵生质体再生和诱变菌株菌丝体产量、菌丝体糖含量及发酵液多糖含量均有较大变化。上述指标在大部分菌株来看均比原始菌产量低、多糖含量也较低。综合分析仅经原生质体再生的 GR一5比出发菌株 (优 G)良，虽然菌丝体及发酵液多糖含量咯低于 G,菌丝但体生长快、量较高，产总多糖含量也比 G高。为此，认为 GR一5可作为下一步深入研究的优良菌株。3小结

31通过对灵芝原生质体再生及紫外诱变的 2 . 4个菌株与出发菌株 (的培养比较研究，现这些菌株 G)发不论在平板培养还是液体发酵培养中均发生了较大

1 3多糖研究 . 】 2

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V l2,o 120 o 1N ,0 0

G R一 3 G R一 4 G R 5

60 . 60 . 8 1 7 7 4. 9 4. 0

GR一 6G R 9 GR一 1 4 GR— l 5 GR一 1 6 GR一 2 7 GR一 3 3 G R一 35 GI 4一 GI 7一 GI 8一 GI 9一 GI 1 一 0 GI l — 7 GI 1 一 8 GI l — 9 GI 2 一 4 GI 2 一 8 GI 2 一 9 GI 3 一 0

78 . 66 . 7. 370 .

54 . 62 . 38 .45 . 47 . 40 .

62 .55 . 7. 9

I8 . 54 .62 . 28 .

G

74 .

菌丝稀疏气生菌丝发达菌落边缘不整菌落边缘不整菌落鞍厚菌落致密气生菌丝发达基生菌丝发达菌落边缘整菌丝平铺菌落致密菌落边缘不整菌丝致密气生菌丝不多菌丝疏松菌丝放射状菌落中心平铺菌丝放射状气生菌丝发达边缘不整菌丝放射状菌丝平铺菌落致密气生菌丝发达

背面白色背面微黄背面微黄背面微黄背面白色背面白色背面微黄背面白色背面白色背面擞黄背面擞黄背面微黄背面白色背面白色背面微黄背面白色背面微黄背面白色背面微黄背面微黄背面中心微黄背面白色背面中心微黄背面中心檄黄

松散 6 m小球、 a r刺状 2 mm小球、状—4刺 2 mm小球—4 l mm小球 l mm小球 l mm小球、刺状松散 2 mm小球—4 2 mm小球—4 4 m小球 a r碎菌丝、松散松散 l mm小球 2 mm小球—4松散 2 rm小球 -4 a松散 2 mm小球—4 2 mm小球—4 2 mm小球—4松散 2 mm小球—4 4 6 m刺状球— r a

白色白色微黄微黄微黄 白

色徽黄徽黄白色白色微黄白色白色白色微黄白色微黄白色微黄微黄微黄 白色微黄擞苗

态；瓶中菌生体生长速度、球状况及产色素等方摇结面。

1北京大学生物系生物化学教研室. 生物化学实验指导，19 9, 2, 7 2 43. 87

3 2通过灵芝原生质体制备再生及诱变实验， 获得

2田秀等.中草药 .90 1 ( )2 6 1 8,15:0 3张惟杰.复合多糖生化研究技术，上海：上海科学技术出版杜 .94 8 1 9:3 4陈国良等.中国食用苗，9 5 1( )7 19,4 4: l 3

了较优良的灵芝菌株 G -5为今后应用研究提供 R-,了优良实验材料。

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