A型流感病毒NS1蛋白研究进展(1)-修改稿 - 图文

A型流感病毒非结构蛋白NS1的研究进展

摘 要：A型流感病毒的非结构蛋白NS1全长约为230aa，包含RNA结合区和效应区两个重要的功能区。A型流感病毒中，NS1是绝无仅有的非结构蛋白，它能够对流感病毒表现出的致病性、毒力等起到相应的调节作用。当前阶段，NS1蛋白全长及两个重要功能区的结构也已经解析，我们可直观的认识其各个功能位点的作用机制。本文关于NS1蛋白的进化、结构、调节病毒的致病性等方面做简要综述。 关键词：A型流感病毒；非结构蛋白NS1；致病性；功能；结构

A型流感病毒属正黏液病毒科，RNA病毒属，是一种严重危害人类及禽畜健康的病毒，感染人、禽、猪等约20种以上的物种。其基因组为单股负链RNA，包含8个大小不同的RNA片段，其中第8条RNA编码非结构蛋白1，即NS1，全长约为230aa。作为A型流感病毒中极为关键的非结构蛋白，其调节活性相对较好。NS1蛋白，只能在已感染病毒的细胞中存在，而单个病毒粒子是没有NS1的，所以才被称为非结构蛋白。NS1能够对流感病毒表现出的致病性、毒力等起到相应的调节作用，其功能位点氨基酸具有很强的遗传保守性。而流感病毒的高度变异性，限制了流感疫苗的使用，常用的抗流感药物也逐渐出现耐药性，因此对NS1的细致探讨，为临床诊断和预防A型流感病毒指明了方向。这几年，NS1蛋白相关的进化、组成、调节病毒的致病性等方面都做了深入的研究，本文对此简要综述。 1. NS1蛋白基因的分群及进化分析

NS1蛋白，最显著的特征在于拥有NS基因编码。NS基因序列有着明显的同源性，据此可将NS基因划分成两个等位，其一为基因群A，其二为基因群B。群内基因具有较强的同源性，高达90%；群和群之间的同源性则只有72%左右[1]. Ludwig等[2]研究发现，基因群A编码所

有的人、猪、马的流感病毒和部分禽流感病毒的NS1蛋白，而基因群B则编码其余的禽流感病毒的NS1蛋白。Suarez[3]等人选取106株NS基因进行分析（均为A型流感病毒，且来自不同地点）。他分别对基因群A、B进行分类，前者被分成成5个分支，后者则被划为2个分支。William G等[4]将研究地点确定为意大利北部，时段为1999-2003年。通过对该地域40株与禽流感病毒（H7N1）相关的NS1基因，最终得出：编码生长正常（230aa）的毒株数量共计16株，C-端缺失编码（220aa）的毒株数量共计6株，其余18株毒株间断性缺失编码（224aa），且C端间隔性缺失者均带有较强的致病性。刚开始流行时，致病性偏低的毒株均拥有较为正常的NS1基因序列；最后，逐渐开始缺失。

2. NS1蛋白的结构

NS1蛋白目前被分为RNA结合区和效应区（即RBD和ED）两个重要的功能区。第1～73位aa为RNA结合区，其中19～38位aa是核心区，能与异源RNA结合[5]。RNA结合区由3个α螺旋（分别是1～30位，30～50位，50～73位aa）构成，它们之间通过环相连，第二个螺旋中的R38位和K41位是NS1蛋白的功能性位点，对NS1蛋白和dsRNA结合具有重要作用[6，7]，第一个NS1全长结构就是将这两个功能性位点突变为丙氨酸后结晶解析出来的。从74位aa开始至羧基端，为NS1的效应区，效应区的功能包括阻断宿主mRNA的剪接，逐渐酸化多聚腺苷，抑制核转运等等[8]。除此之外，34～44位和203～237位是2个核定位信号区（NLS）。34-44位相对较为保守，且普遍出现于A型流

感病毒株身上，序列Asp-Arg-Leu-Arg-Arg；而后者仅发现在部分病毒株中。 2.1 RNA结合域

通过对PDB晶体结构当前所建立起的数据库进行检索，我们发现：A型流感病毒相关的NS1蛋白，共检索到6条RBD晶体记录。我们对6个被检索到PDB及其ID进行统计，结果如下：1）1NS1；2）1AIL；3）2ZKO；4）2ZOA；5）3F5T；6）3M8A。借助DiscoveryStudio2.1软件，我们对上述RBD结构做出系统分析，最终得出：二级结构均拥有相同的折叠方式，其区别仅在于两个细节方面：一个为loop区；另一个则为少数氨基酸侧链。RBD单体结构均由3个α-螺旋组成，分别为α1、α2、α3（分别是1～30位，30～50位，50～73位aa），螺旋之间由loop区连接[9]。RBD结构如图1所示[10]。通过结构分析，RBD结构域是一个对称的同源二聚体，这种二聚体结构在不同的毒株之间高度保守，6个螺旋的同源二聚体来识别dsRNA的[10,11]，其中R38位和K41位是NS1蛋白的功能性位点，对RBD的RNA结合至关重要。图2为RBD与dsRNA复合物晶体结构（PDB ID：2ZKO），二聚体和dsRNA结合比是1：1，已经解析出NS1 RBD与dsRNA的相互作用模式：RBD表面有一个较深的口袋，2个反向平行的a-螺旋a1、a1'形成口袋的底面，实现对dsRNA的结合，四壁由反向平行a-螺旋a2 、a2'形成。

引自[Liu, J., et al..Nat Struct Biol, 1997. 4(11): p. 896-9.]

图1 RBD的晶体结构

Fig.1 Cartoon representation of the RBD structure

引自[Cheng, A., S.M. Wong, and Y.A. Yuan. Cell Res, 2009. 19(2): p. 187-95.]

图2 RBD和RNA复合物的晶体结构

Fig.2 Overall structure of NS1A RBD bound to siRNA duplex.

截止今日，在NS1-RBD中，有关RNA结合功能仍未得到彻底明确。下列观点已得到医学界的认可：RBD、dsRNA两者间的结合能够对dsRNA起到一定的隔离作用，使其无法和细胞里面能够诱导I型干扰素激活的其他蛋白发生作用，最终使得宿主细胞不能产生β-干扰素，从而拮抗了宿主细胞的抗病毒反应。NS1蛋白的功能依赖于它结合的RNA类型：与成熟细胞mRNA的3'-poly（A）结合的时候，可抑制其mRNA核输出[12]；与双链RNA（dsRNA）的结合，通过间接阻止

α/β干扰素的生成来降低宿主细胞的抗病毒能力；与U6snRNA、U6atacsnRNA的结合，对前体mRNA的剪辑进行抑制[13-14]；另外NS1与病毒RNA结合后，再与结合eIF4GI的ED进行联合，以提高病毒的翻译等。 2.2 效应区结构

通过对PDB晶体结构当前已建立起的数据库进行检索，我们发现：A型流感病毒相关的NS1蛋白，共检索到9条ED晶体记录。我们对9个被检索到PDB及其ID进行统计，结果如下：1）2KKZ；2）3EE8；3）3EE9；4）3D6R；5）2RHK；6）2GX9；7）3F5T；8）2RHK；9）3KWI。借助DiscoveryStudio2.1软件，我们对上述RBD结构做出系统分析，最终得出：除在loop区以及羧基端末尾处有所不同外，二级结构几乎相同[15,16,17]。晶体学研究显示，效应区都可以独立的进行二聚化，每个单体由个7个β-链和3个α-螺旋组成。效应域包含细胞、蛋白两者间多个不一样的结合位点。最常见的有：1）延伸起始因子(简称eIF4GI)；2）双链RNA依赖的蛋白激酶(简称PKR)；3）多聚腺苷酸结合蛋白II（简称PAB II）等，它们均拥有蛋白的属性、功能。目前只有NS1-CPSF30复合物的晶体结构，NS1与其它蛋白的相互作用机制研究的并不是很清楚。此外，ED对NS1二聚体的形成和稳定有一定作用[16]。

2.3 NS1蛋白全长晶体结构

2008年12月, Bornholdt和Prasad等[15]报道了A型禽流感病毒株H5N1(A/Vietnam)内部NS1蛋白所具有的晶体结构（ID：3F5T），该