微生物限度检查若干问题剖析

微生物限度检查若干问题

微生物限度检查若干问题

微生物限度检查是对非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，是药品微生物学检验的重要内容之一。中国药典2000年版二部附录ⅪJ“微生物限度检查法”、《中国药品检验标准操作规范》（2000年版）及参考书《药品微生物学检验手册》均做了详尽的阐述。下面对几个比较重要的问题，谈一点工作学习体会，仅供参考。 一、实验室要求

开展微生物限度检查工作，首先要按照《药品检验所实验室质量管理规范》及《药品生产质量管理规范》的要求，建立一个布局合理，使用方便，操作安全的实验室，并且配有完善的实验设施和管理制度。微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物检定实验室以及接种室（接种对照菌及菌种传代）均应严格分开。 （一）无菌室： 1结构与要求：

最好设在二楼以上（防潮、防霉、采光好），面积不超过10平方米，高度不超过24米，由2个缓冲间和操作间组成。缓冲间与操作间之间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒，墙壁与地面、墙壁与天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙、无死角。

无菌室内光照应不低于300勒克斯，缓冲间和操作间均应装有紫外线

杀菌灯2-25w/m3作空气消毒用。紫外线波长200-300nm者''具有杀菌作用，其中以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。其杀菌机理可能是在DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰DNA复制，导致细菌变异或死亡。紫外线杀菌灯1m以内距离杀菌效果最佳''每次开灯照射时间为20min。其缺点：穿透力弱，一张纸可以挡住，不能穿透固体物，对人的皮肤眼睛有损伤，所以紫外线灯开关应装在无菌室外便于开关。

2温度、湿度：温度应控制在18-26℃''相对湿度40-60''操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正比''不低于49Pa。

3操作间：应安装空气除菌过滤层流装置，操作间不应安装下水道，洁净度不低于1万级，净化工作台局部应为100级。操作间应准备电子称（感量01g''最大称量300g''乙醇灯''火柴''2碘酊及75乙醇棉球，大、小橡皮乳头，记号笔，灭菌的剪刀，镊子、注射器等。

4缓冲间：应有洗手盒、消毒液、无菌衣、帽、口罩，拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物。

（二）洁净级别及检查方法：

通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。

98年国家药监局颁布药品生产质量管理规范''把药品生产洁净区空气洁净度划分为四个级别： 空气洁净度级别表

──────────────────────────── 尘埃数/立方米活微生物数个

洁净级别─────────────────────

≥05μm≥5μm浮游菌/立方米沉降菌/皿 ──────────────────────────── 100级≤3500≤0≤5≤1 1万级≤35万≤2000≤100≤3 10万级≤350万≤2万≤500≤10

────────────────────────────

尘埃数：用尘埃粒子计数器测定，取样高度离地面1米，间距05-2米''每个测试点连续采样3-5次，仪器显示结果。

沉降菌数测定：无菌室及净化工作台面消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将营养琼脂平板3个及改良马丁琼脂平板3个直径9cm，置净化台左、中、右各1个''开盖，暴露30min后将盖盖上。分别在30-35℃培养48h及25-28℃培养72h''细菌和真菌总数不超过1个为100级。 无菌室应在每次操作前后均用01苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭台面及紫外线照射不到可能污染的死角；用消毒液湿拖地面。实验室一旦被污染''洁净度达不到要求''可以清洗或更换净化工作台过滤器''甲醛或丙二醇''乳酸熏蒸消毒''方法：支架上放一个烧杯（内装少许甲醛，8ml/平方米''下面放一个装有少许乙醇的乙醇灯点燃后，关闭门窗，乙醇用尽后灯自灭，甲醛蒸气充满无菌室，密闭24h。

缺点：甲醛蒸气易锈蚀仪器，对人有刺激，可用氨水中和，减少对人眼的刺激。 二、无菌操作

指在无菌的环境条件下，使用无菌的器材，防止微生物污染的操作技

术。从事微生物检验的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识培训，才具备上岗操作的资格。所用的物品需清洗、干燥、包扎，无菌。 干烤箱160℃2h''适用于培养皿9cm、试管、吸管、锥形管、剪刀、镊子物品的灭菌；培养基及09氯化钠溶液用高压锅湿热灭菌''含糖培养基一般用113℃30min''以防温度过高成分被破坏；一般培养基115℃30min;09氯化钠溶液可用121℃20min即可。

操作者在缓冲间换拖鞋，用肥皂洗手后，穿戴无菌工作服、帽、口罩，操作前用01苯扎溴铵泡手''75乙醇棉球擦拭双手后''在乙醇灯火焰区操作。操作中切勿用嘴直接吸吹吸管防止致病菌感染操作人员及口中的杂菌污染供试品。

三、药品微生物检验的特点

（一）活体易变性：被污染的供试品中活的微生物具有繁殖能力，如细菌以二分裂法无性繁殖，20分钟繁殖一代，一个细菌10个小时后可变成10亿个细菌。如糖浆剂细菌数标准为100个/ml，出厂时检验结果合格，由于贮存不当，放置一段时间成为不合格药品，由于营养成分耗尽细菌自身代谢产物所致的毒性或pH值改变''细菌逐渐死亡，又成为合格药品。 （二）分布不匀：由于生产环节多，从原料、中介体到成品，经过生产多个流程，与不同操作人员接触，特别是生产后期被污染，通常是局部的，药品微生物的污染存在着不均性。

要求：随机取样，二个包装以上，操作前，供试品摇匀后取样。 （三）受损状态：药品中污染的微生物，受到加工、加热过程的机械损伤，药品本身的抑菌杀菌作用，处于受损抑制状态，检验时必须创造适

宜的生长环境（培养基的营养、pH值等）使细菌复苏，从而提高检出率。如口服制剂，必须检查控制菌大肠杆菌，取1:10的供试液10ml加入胆盐乳糖增菌液中，胆盐乳糖增菌液是分离大肠杆菌的选择培养基，蛋白胨乳糖等成分提供氮源碳源外，胆盐是抑菌剂，对革兰阳性菌有良好的抑菌作用，从而使目的菌更好地生长。

（四）生态环境多样复杂性：药品的种类、剂型繁多，使污染的微生物生态环境多样而复杂。故对不同的供试品分别采用不同的方法，正确地制备供试液，使药品中污染的微生物得以真实反映，是保证检验结果正确可靠的重要前提条件。 四、供试液的制备：

将供试品制成供试液（一般为1:10），有利于供试品中污染的微生物分散，与培养基充分接触，提高阳性检出率。

常用稀释剂为09无菌氯化钠溶液，滴眼剂、王浆、蜂蜜制剂可直接用供试品（原液），作为供试液。

在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于25cm，上下反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第2级稀释管的内壁在液面上1cm处缓慢吹出全部液体。每个稀释级需更换吸管。 （一）一般供试品供试液的制备：

1液体制剂：糖浆剂等取样10ml至含有玻璃珠的锥形瓶内，加入09无菌氯化钠溶液90ml1:10的供试液。油剂：取样10ml''加聚山梨酯-805ml''再加稀释剂至100ml。不提倡将稀释剂定量分装后再灭菌，因高压灭菌易使