蛋白质定量的五种方法(2)

考马斯亮兰结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法。本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。 【原理】

考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250 的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮兰G250-蛋白质定量测定的高敏性度。 在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物呈青色。在595nm下，光密度与蛋白质 含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。 【操作】(常量法) (一)标准曲线制备：

配制lmg／ml的标准蛋白溶液。制备系列稀释液，其浓度分别为1000μg／ml，500μg／ml， 250μg／ml，125μg／ml ，62.5μg／ml和31.25μg／ml。 按下表操作：

摇匀，室温静置3分钟。在第一管为对照管，在721型分光光度计于波长595nm处比色-读取光密度。以各管光密度为纵座标，各标准样品浓度(μg／ml)作为横座标作图得标准曲线。 (二)未知样品测定：

取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，摇匀。(此法样品稀释200倍)。 取试管二只，按下表操作：

摇匀，静置3分钟，在721型分光光度计亡波长595nm比色，读取光密度，查标准曲线，求得稀释样品蛋白质浓度。 【计算】

未知样品蛋白质浓度μg／ml＝稀释样品浓度×稀释倍数 【优缺点】

(—)操作简便、快速；检测灵敏；重复性好。

(二)显色迅速。约于2分钟内完成染料与蛋白质的结合。所现颜色至少在l小时内是稳定的。

(三)与改良Lowry氏法相比，干扰物质较少。

(四)当样品中存在较大量的十二烷磺酸钠(SDS)、TritonX-100等去垢剂时，显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色，故必须预先处理样品。

(五)考马斯亮兰G250染液不宜久存，以1-2月为宜。

(六)微量法测定蛋白含量范围为1-10μg；常量法测以检测范围10-100／μg为宜。 【器材】 (一)试管l0支

(二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。 （三）721分光光度法，普通比色杯4只。 【试剂】 (一)O.9％NaCl (二)待测血清 (三)标准血清

(四)染液：考马斯亮兰G250 0.1克溶于0.5 m1 95%乙醇。再加入100m1 85％(W／V)磷酸。然后加蒸馏水定容到1000ml。[此时溶液为0.0l％考马斯亮兰G250／4.7％(W／V)／乙醇／8.5%(W／V)磷酸]。

方案五 BCA法测定蛋白质浓度

【目的】：掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理。 【原理】：

BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，

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蛋白质将Cu还原为Cu，一个Cu螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。 【操作】

标准曲线的绘制：取试管七支、编号

【计算】

（一） 绘制标准曲线。

（二） 以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 （三） 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 【优缺点】

(一) 操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；

(二) 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。

(三) 经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；

(四) 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响。 【器材】

（一） 7220型分光光度计 （二） 恒温水浴箱 （三） 中试管7支 （四） 枪式移液管 【试剂】

1、 试剂A：1％BCA二钠盐 2％无水碳酸钠 0.16%酒石酸钠 0.4％氢氧化钠 0.95％碳酸氢钠

混合调PH值至11.25。 2、 试剂B：4％硫酸铜。

3、 BCA工作液：试剂A 100ml ＋ 试剂B 2ml混合。

4、 蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定） 5、 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。

此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。

总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。