蛋白质定量的五种方法

蛋白质定量的五种方法

方法一 双缩脲法测定蛋白质浓度

[目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。 [原理]

双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。 [操作]

取中试管7支，按下表操作。

各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 [计算]

(一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质 浓度。

(三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g／L)。 [器材]

中试管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。

[试剂]

(—)6N NaOH：称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。

(二)双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 3.0克，酒石酸钾9.0 克和碘化钾5.0克，分别溶解后混匀，加6N NaOH l00ml，最后加水至1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。如有暗红色沉淀出现，即不能使用。 (三)0.9％NaCl。

(四)蛋白质标准液(10mg／m1)，称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0mg／m1作为蛋白质标准液。

(五)待测血清样本：将人血清或动物血清用生理盐水稀释10倍后再测定。

方案二 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度

[目的]掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。 [原理]

蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。 [操作]

取试管7支、编号、按下表操作：

生理盐水

生理盐水

立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。 操作注意事项： 1． 按顺序添加试剂

2． 试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。 [计算]

(一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 (二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。 (三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。 [器材]

(一)721型分光光度计 (--)恒温水浴箱 (三)中试管7支

(四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。 [试剂] (一)试剂甲

(1)4％碳酸钠(Na2CO3)溶液 (2)0.2N氢氧化钠溶液

(3)1％硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O) (4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)

在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。 (一)试剂乙：

(1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。

(2)或取Na2WoO42H2O l00g和Na2MOO3 25g。溶于蒸馏水700ml中，再加85％ H3PO4 50ml和HCl(浓)100ml，将上物混合后，置1000ml圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水数滴。继续沸腾15分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml然后过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后酸度为1N。 (三)标准蛋白质溶液

用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成0.25mg／ml的蛋白质溶液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)。

(四)待测样品：准确取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9％NaCl溶液至刻度，充分混匀，也可以用尿液为样品。

方案三 紫外分光光度法测定蛋白质浓度

[目的]：掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理，熟悉紫外分光光度计的使用。 [原理]

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考。另外，不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD260nm，与OD280nm。，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。

本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。主要缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生—定误差，混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。 [操作]

取试管7支，按下表操作： 0.4 3.6

各管混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以空白管调节零点，分别于280nm、260nm波长下测定各管光密度， [计算]

(一) 直接根据标准液与待测液的光密度值(OD280nm)，或从标准曲线，求得样本蛋白质含量。

以标准管各管光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线，然后根据测定管光密度值，直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量。

1． 选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品，用生理盐水稀释至浓度为 lmg／m1，作为稀释标准蛋白质溶液。

2．用生理盐水稀释待测样本蛋白质至浓度约为lmg／m1，即为稀释样本蛋白质溶液。

(二)利用经验公式直接计算样本蛋白质含量，

准确吸取血清样本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即500倍稀释，在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。

1、OD280／0D260＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式： 样本蛋白质含量(mg／m1)＝1.45OD280一0.74OD260 2、OD280／OD260﹥1.5时，用Lamber-Beer定律计算：

样本蛋白质含量(mg／m1) = OD280／K×L＝（OD280／6.3×1）×10g／L 本实验样品：牛血清白蛋白E1%cm＝6.3（100ml／cm.g） K：克分子消光系数；E1%cm：百分比吸光度的吸光系数；

注：不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故标准管与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似 …… 此处隐藏：1657字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……