TaqMan法进行实时定量PCR鉴定

3.3 TaqMan法进行实时定量PCR鉴定

较普通PCR而言，实时定量PCR有更高的灵敏度，因此需要进一步优化反应条件。PCR反应在Applied Biosystems StepOneTM Real-Time PCR System (ABI公司仪器)sequence detector中进行。采TaqMan法进行绝对定量ρ0 HeLa细胞中mtDNA的拷贝数。

3.3.1 荧光定量试剂及探针

(1) Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)，购自宝生物工程（大连）有限公司。

(2) PCR 反应引物以及探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

3.3.2 构建质粒标准品的目的片段的扩增及纯化

本试验对以往所报道拷贝数的文献进行了筛选，通过比较选用了常用的核基因中的β-actin基因做为的参照，Cox-I基因做为正常线粒体基因[40]，其中β-actin基因的引物为实时荧光定量的引物，Cox-I基因的引物则为本实验室扩增线粒体全序列的引物中的第九对引物[41]。引物所在位置、引物序列、目的片段的长度以及复性温度见表6。引物处理、PCR试剂、反应体系等同前面扩增PCR，复性温度依据表6。扩增目的片段并纯化之后与T载体连接。

引物名称 引物位置 引物序列（5’→3’） 目的片段长度 复性温度

107 bp 58 ℃ β-actin F 1997-2017 ACCCACACTGTGCCCATCTAC

β-actin R 2103-2081 TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA

Cox-I F1 5835-5855 GAGGCCTAACCCCTGTCTTT

Cox-I R1 6661-6642 ATTCCGAAGCCTGGTAGGAT 827 bp 59 ℃ 表6 F表示正向引物，R表示反向引物。β-actin F与β-actin R用于扩增β-actin基因的一段区域缺失区域，引物序列同荧光定量时引物序列；Cox-I 1 F与Cox-I R1用于扩增Cox-I基因的一段序列。

3.3.3 感受态的制备（于超净工作台无菌条件下及冰上操作）

(1) 取上述1 ml培养液于1.5 ml EP管。

(2) 4 ℃ 4000 rpm 离心5 min，弃上清。

(3)加入100 μl冰中预冷的Solution A，轻轻弹动使沉淀悬浮（可轻轻吹打）。

(4) 4 ℃ 4000 rpm 离心5 min，弃上清。

(5) 加入100 μl 冰中预冷的Solution B, 轻轻弹动使沉淀悬浮。

(6) 感受态细胞制作完成（可直接用于DNA转化实验或-80 ℃保存，以备后用）。

3.3.4 目的DNA片段的连接及感受态细胞的DNA转化

(1) 在微量离心管中配制下列DNA 溶液，总量为5 μl。

pMDTM 18-T Vector 1 μl

Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol

dH2O 补至 5 μl

(2) 加入5 μl（等量）的 Solution I。

(3) 16 ℃连接过夜（8小时）提高反应效率及连接产率。

(4) 取-80 ℃保存感受态细胞冰中融化10 min。

(5) 取100 μl的感受态细胞移至新的EP管中。

(6) 向感受态细胞中加入（3-10 μl）的转化用DNA(连接产物)，轻轻混匀后冰中放置30 min。

(7) 42 ℃水浴中放置45 s-60 s后，立即于冰中放置1-2 min。

(8) 加入890 μl 37 ℃预温的SOC培养基。

(9) 37 ℃振荡培养1 h（﹤200 rpm）。

(10)取适量于含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，将平板倒置于37 ℃培养箱中培养过夜形成单菌落，计数白色、蓝色菌落。

(11)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。确认培养菌落，进行下步实验。

(12)取3 ml LB各支加3 μl氨苄，挑取菌落于其中，37℃（150-200 rpm）轻振荡过夜。

3.3.5 使用质粒提取试剂盒提取质粒

测序以及质粒浓度的测定时对质粒DNA的纯度要求较高，本试验采用宝生物公司的质粒提取试剂盒MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0进行质粒的提取。该试剂盒是用于质粒（Plasmid）DNA 小量纯化的试剂盒，采用了传统的 SDS 碱裂解法，结合DNA 制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需 1 小时便可完成。使用本试剂盒可从 1～4 ml 的过夜培养的菌液中纯化得到1～20 μg 的高纯度质粒DNA（OD260/OD280 = 1.8～2.0），此质粒DNA 可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。

RNase A1(50 mg/ml) 32 μl Solution Ⅰ 15 ml

Solution Ⅱ 15 ml

Solution Ⅲ 24 ml

Rinse A 28 ml

Rinse B 80 ml

Elution Buffer 4 ml

(二)按照MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0说明做如下操作：

(1) 取菌液1.5 ml于1.5 ml的离心管中，12000 rpm 离心2 min 弃上清。

(2) 用250 μl的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀 (一)试剂盒组成

（注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器等剧烈振荡使菌体充分悬浮）

(3)加入250 μl的SolutionⅡ轻轻地上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。（注：此步骤不宜超过5分钟）

(4)加入400 μl的4℃预冷的Solution Ⅲ轻轻地上下翻转混合5-6次，直至形成紧密凝集块，然后室温静置2分钟。

(5)室温12000 rpm离心10 min，取上清。（注：此时4 ℃离心不利于沉淀沉降）

(6)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

(7)将上述操作6的上清液移至Spin Column中，12000 rpm离心1 min，弃滤液。

(8)将500 μl的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。

(9)将700 μl的RinseB加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。（注：请确认RinseB中已经加入了指定体积的100％乙醇）

(10)重复操作步骤9

(11)将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央加入60 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。（把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60 ℃，使用时有利于提高洗脱率）

(12)12000 rpm 离心1 min 洗脱DNA。

3.3.6 质粒DNA酶切鉴定

(1) PMD18 酶切位点如图3所示，本试验选用了BamHⅠ(5-G^GATCC-3)及PstⅠ(5-CTGCA^G-3)来进行双酶切反应。

(2) 酶切体系如表7所示

表7 酶切反应体系

反应体系成分

内切酶（BamHⅠ及PstⅠ）

10 ×Buffer K

DNA

灭菌水

总计

体积 1 μl 2 μl 10 μl 6 μl 20 μl 置37℃水浴锅酶切3个小时，随后加2 μl 10×loading Buffer终止酶切。

图3 PMD18载体的结构及酶切位点示意图

(3) 电泳鉴定

用2%琼脂糖凝胶，同时点样100bp DNA Marker,在1×TAE 缓冲液中，以5V/cm 电压进行电泳，约30min。于紫外灯下照射观察并采用用Gene Genius BioImaging System紫外凝胶分析系统进行成像分析。

3.3.7 质粒DNA测序验证

对提取的含有目的片段的质粒DNA进行序列测定。测序结果用CodonCode Aligner 2.0.6与修正后的剑桥序列作为参考序列。利用CodonCode Aligner软件中的Assemble和Align to reference sequence功能，将所测序列与参考序列比对观测是否转入了目的片段，并对所有的测序峰图进行人工核对确保准确无误。

3.3.8 质粒DNA浓度的测定

提取的含有相应目的片段的质粒DNA各取10 μl并加入90 μl的Elution Buffer稀释10倍之后使用核酸/蛋白分析仪（DU® 800）测其OD值，并依据如下公式计算其拷贝数。

待测标本浓度（ng/μl）=OD260×50×稀释倍数