第二次普通微生物学实验(4,6)

实验四 革兰氏染色法一、目的要求 学习革兰氏染色原理，理解着色机理 着色机理。 1 学习革兰氏染色原理，理解着色机理。 掌握革兰氏染色的方法 并能正确染 革兰氏染色的方法， 2 掌握革兰氏染色的方法，并能正确染 色。 巩固无菌操作技术 3 巩固无菌操作技术 4 巩固显微镜油镜的使用方法

二、基本原理是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。 1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。 年由丹麦病理学家C.Gram所创立的 革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法。 革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法。 细菌学上最常用的鉴别染色法 革兰氏染色是是根据革兰氏阳性细菌、 革兰氏染色是是根据革兰氏阳性细菌、阴性细 细胞壁结构、组成的不同而使用一系列的染 菌细胞壁结构、组成的不同而使用一系列的染 色处理使之差别显色 差别显色。 色处理使之差别显色。 其染色方法是先将细菌分别用结晶紫和碘液初 染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂复染。 染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂复染。最终 被染成红色的是革兰氏阴性细菌 被染成紫色 红色的是革兰氏阴性细菌； 被染成红色的是革兰氏阴性细菌；被染成紫色 的是革兰氏阳性细菌 革兰氏阳性细菌。 的是革兰氏阳性细菌。

革兰氏染色原理： 革兰氏染色原理：第一步： 第一步：结晶紫使菌体着上紫色 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大， 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大， 能被细胞壁阻留在细胞内。 能被细胞壁阻留在细胞内。 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同， 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出 现不同的反应。 现不同的反应。 细胞壁厚 肽聚糖含量高，交联度大， G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当 乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小， 乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶 碘复合物被阻留在细胞内， 紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱 仍呈紫色。 色，仍呈紫色。 肽聚糖层薄 交联松散， Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使 其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙 其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解， 加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁， 加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞 脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。 脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。

1

2

结晶紫 碘液 酒精 复红

3

4

三、实验材料大肠杆菌( 培养) 大肠杆菌(24h培养)斜面菌种 培养 枯草杆菌( 培养) 枯草杆菌(12h培养)斜面菌种 培养

四、方法步骤

1

1 涂片、干

燥、固定：同简单染色。 涂片、干燥、固定：同简单染色。 2 初染：滴加结晶紫染色 初染：滴加结晶紫染色1min,后用水冲洗。 结晶紫染色 ，后用水冲洗。 3 媒染：滴加碘液染色 媒染：滴加碘液染色1~2min,后用水冲洗， 碘液染色 ，后用水冲洗， 甩尽残余水 4 脱色：用95%乙醇冲洗 秒(需要严格控 脱色： 乙醇冲洗30秒 乙醇冲洗 制时间和浓度),然后立即用水冲洗。 ),然后立即用水冲洗 制时间和浓度),然后立即用水冲洗。 5 复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行 复染： 复染，蕃红染2~3min,如果石炭酸复红染 复染，蕃红染 ，如果石炭酸复红染 1min。水洗，晾干。 。水洗，晾干。 6 镜检：先用低倍镜观察，后用油镜观察 镜检：先用低倍镜观察，后用油镜 油镜观察

革兰氏阳性杆菌

革兰氏阴性杆菌

五、注意事项1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不 、载玻片要洁净无油迹。涂片时， 要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀， 要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜 宜薄。 宜薄。 2、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 酒精脱色 3、染色过程中勿使染色液干涸。 、染色过程中勿使染色液干涸。 4、选用幼龄的细菌。 、选用幼龄的细菌。

实验六 微生物细胞大小测定一、实验目的 学习用镜台测微尺校正目镜测微尺的方 法★ 学习并掌握用目镜测微尺测定细菌细胞 大小的方法★★ 大小的方法★★ 巩固显微镜油镜的使用方法

二、实验原理测定微生物细胞大小是在显微镜下利用测微尺进行。 测定微生物细胞大小是在显微镜下利用测微尺进行。 测微尺进行 测微尺可分为目镜测微尺和镜台测微尺。 测微尺可分为目镜测微尺和镜台测微尺。 目镜测微尺 目镜测微尺是特制的圆形玻片，中央有一刻度尺( 目镜测微尺是特制的圆形玻片，中央有一刻度尺(100 是特制的圆形玻片 等分),可放入目镜镜筒内，用于测定细胞大小。 等分),可放入目镜镜筒内，用于测定细胞大小。 ),可放入目镜镜筒内 镜台测微尺为一载玻片，上贴有圆形盖片， 镜台测微尺为一载玻片，上贴有圆形盖片，中央有总 为一载玻片 长度为1mm(100等分 ，每小格长 等分),每小格长0.01mm(10µm) 。 长度为 等分 目镜测微尺每小格大小随显微镜放大倍数不同而改变， 目镜测微尺每小格大小随显微镜放大倍数不同而改变， 使用目镜测微尺进行测量之前必须用镜台测微尺标定， 使用目镜测微尺进行测量之前必须用镜台测微尺标定， 以求出在某一放大倍数下目镜测微尺每小格所代表的 长度，然后用标定好的目镜测微尺进行测

量。 长度，然后用标定好的目镜测微尺进行测量。

三、 实验材料枯草杆菌标本片

四、实验方法步骤1)用镜台测微尺标定目镜测微尺。 )用镜台测微尺标定目镜测微尺。 2)用目镜测微尺测定枯草杆菌大小。 )用目镜测微尺测定枯草杆菌大小。

(1)用镜台测微尺标定目镜测微尺。 )用镜台测微尺标定目镜测微尺。放置目尺：取出目镜，旋开接目镜， 放置目尺：取出目镜，旋开接目镜，将目尺放 在目镜镜筒的中间隔板上( 在目镜镜筒的中间隔板上(有刻度的一面朝 ),旋上接目镜 并插入镜筒。 旋上接目镜， 下),旋上接目镜，并插入镜筒。 放置台尺：将台尺放置于显微镜的载物台上， 放置台尺：将台尺放置于显微镜的载物台上， 使刻度面朝上。 使刻度面朝上。 标定目尺：先用低倍镜观察，找到台尺刻度， 标定目尺：先用低倍镜观察，找到台尺刻度， 转动目镜使目尺与台尺的刻度轴线相平行， 转动目镜使目尺与台尺的刻度轴线相平行，移 动台尺使目尺与台尺某一区间的两对刻度线完 全重合，然后计数出两重合线间各自所占格数， 全重合，然后计数出两重合线间各自所占格数， 通过如下公式计算： 通过如下公式计算：目尺每小格长度( 目尺每小格长度(um)= ) 两对重合刻度线之间台尺所占格数× 两对重合刻度线之间台尺所占格数×10 两对重合刻度线之间目尺所占格数

数 标定低倍镜目尺每小格所代表的实际长度

(2)用目镜测微尺测定枯草杆菌大小 )取下台尺，将染色片放在载物台上， 取下台尺，将染色片放在载物台上，先 用低倍镜观察，后换油镜观测， 用低倍镜观察，后换油镜观测，计量细 长和宽所占小格数 所占小格数， 菌长和宽所占小格数，将测得格数乘以 已标定的目尺每小格长， 已标定的目尺每小格长，即得菌体实际 大小。 大小。 分别选择5个大的和5个小的菌体， 分别选择5个大的和5个小的菌体，并测 量其长、宽数值，求出平均值， 量其长、宽数值，求出平均值，以正确 格式表示细菌大小。 格式表示细菌大小。