随机引物PCR及其应用的研究进展

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《海畜牧兽医通讯》 2 0上 0 6年第 3期

随机引物 P R及其应用的研究进展 C李雪华刘应鹏江倩王艳玲刘兴友 t(1河南农业大学河南郑州 4 0 0 2河南科技学院 502河南新乡 4 30 5 0 3)

随机引物 P R ( a dm mpf d p l rh N C R n o a li oy p i D A, ie mo c R P )术是 19 AD技 9 0年由 W ia l ms等…建立起来的一项 l i

随机引物 P R技术所受影响因素比较多【,要表现 C 4主】在以下几个方面：

D A多态检测技术，称作靶序列循环扩增选择法 (yl N也 ccc ia li t nadsl t no resC S,数式富集配体 mp fai n e ci f agt, A T)指 ic o e o t系统进化法 (￣tmai eo tno gn sb xo et l l s e t v l i fl ad yep nni 1 c uo i a e. . r h etS L E)选择性扩增结合位点法 (e ce n m. i m n,E E, c sl tdada e pie i i i,AB )靶序列检测分析 (agtdt t n li b dn s e S S、 fd n g t t e ee i r co

2 2 1模板 D A的质爨：机引物 P R实验结果的可重 .. N随 C复性是大家普遍关心的问题，类问题的主要原因是由于模这板 D A的质量不合格引起的。检查模板 D N NA的质量是否合格的简单方法是在 2 0n~2 0P一范围内对 D A作 0 g 0 g这 N一

系列的 (/ )释，果一定浓度的 D A用不同的引物均 12稀如 N

asy T A)随机扩增多态性 D A分析 (a dm a li s,D和 a N rn o mpie fd plm rhcD A aa s A D等【。该技术以 P R为 oy op i N nl i R P A) 2 ys J C基础，用一系列单一的人工合成的随机寡核苷酸链作引利物，对所研究的基因组 D NA进行 P R扩增。在该技术问世 C

不能产生可靠的指纹，么模板的质量就值得怀疑了。解决那这一问题的方法是制各较高质量的模板，免污染非靶避 D A序列， N选择合适的模板 D NA浓度，

每种样品实验开始时至少要用两种浓度的 DN A模板进行分析 J。

的短短几年内，因其独特的检测 D A多态性的方式以及简便快 N速等特点而迅速渗透到分子生物学研究领域的各个方面。

2 2 2引物的选择： ..随机引物可用于所有物种，对某些特但定的研究对象要获得 D NA多态性仍需进行引物筛选和 P R C反应条件的优化；并非所有的随机引物均能扩增出有意义的结果，所以应进行多个引物的尝试，中选出较为理想的分从析引物：般情况下应选择能产生中等复杂度图谱的引物。一 223 P R反应条件：果的重复性与实验条件密切相关， . . C结 不同实验室得到的结果可能缺乏可比性；外同一实验室因另

1随机引物 P R的基本原理 C随机引物 (ad m pi e rn o r r或 nn—seicpi r是指使 m o pc i r ) f me用非特异序列的寡聚核苷酸 (常长度为 1通 0个碱基 )为作

D NA合成过程中的引物，与一般常用引物的区别在于其它随机性或是与特异性相对的概念，括两方面的含义：1核包 ()

苷酸的排列顺序是随机的；2所有引物的的序列无直接相 ()关性【。其基本原理是在低温退火温度下， 3 J用适当的一系列

其选择的引物不同，反应控制的条件( M浓度，如 d模板浓度)同，得指纹图谱亦不相同。不所

(通常约数百个)基排列顺序不同的寡聚核苷酸单链 D A碱 N分子 (常长度为 1通 0个碱基，0聚体 )引物，所研究的基 1为以

所以要求在运用这一技术时尽量考虑到对引物的选择及不同批次实验条件的一致，时应将研究的重点放在同一同条件下所得结果的解释。

因组 D NA或 R NA反转录产生的 e NA作模板，行 P R D进 C

扩增。理论上，不一定要求整个引物都与模板复性，只并而要引物的一部分特别是 3端有 3’~4个以上碱基与模板互补

2 3随机引物的设计 .因为随机引物 P R不需要特异引物，择引物时亦不 C选能按已知 DN A序列进行设计合成，以任何引物均可用所 r C方法扩增出 rC指纹图，于引物的碱基数目，理 PR PR关从

复性即可使引物延伸。

若模板 D NA的两条链相距一定距离且有反向复性引物存在，可经 Ta NA聚合酶的作用使则 qD引物延伸而发生 DN A片段的扩增，多个随机引物可以使检测区域扩大至整个基因组。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰

论上讲，引物越短，成与模板错配的机会越多，造因而显示的指纹图条带越多，般常用的长度为 8~1 p有的可达一 0b,2 p左右。 0b

胺凝胶电泳分离， B染色或放射性自显影得到 D A指纹图 E N谱，而分析比较其多态性¨。进]随机引物 P R除在引物的选择上与常规 P R有所不同 C C外，C P R循环温度也较低，般选择在 2~3℃,0以上一 5 5 4℃

3随机引物 P R技术的应用 C 3 1在传染病流行病学和病原系统发生学中的应用 . rC P R在传染病流行病学和病原系统发生学方面得到了

时扩增效率逐渐减弱，度太低非特异性扩增带型过多，温使结果解释混乱。当然，度的选择与引物的长短有关，长温较的引物退火温度可降低，之就要提高退火温度。反

较为广泛的应用。F re等用两种引物检查 1 abr 5株李斯特单核菌相关流行分离株和 3 6株不相关流行分离株。扩增经后的带型分析，其分为 9个型，个型中又分有不同的亚将每

2随机引物 P R的特点 C2】随机引物 P . CR的优点随机引物 P R不仅克服了同工酶位点偏少的缺点， C避

型。MA o b r Wod un等’不同来源的 3对 1株蚊致病型和 l 4株非蚊致病型 B c l p ar u用 8种引物进行 P R分析， aiu shei s ls e C 共观察到 2 5条带， 6分型结果比血清学分型和噬菌体分型要好。进行重复实验后，带型恒定，每一型都具有特定带型，且分型结果可长期保存。We h等【应用该技术对 5 l s 8 种葡萄球菌、1链球菌进行检测，研究了影响产物重复性、和株 1株并种特异性和随机引物 P R指纹图的参数。指纹图带的数量、 C

免了 R L F P操作技术复杂的弊端 (无需制备克隆，同位素标记，o ten印记分子杂交 )使其在短时间内获得大量的分 S uhr,

子标记成为可能，

且能检测每个基因位点，态性含量丰而多富，变化范围大 ( 02~0 9;外，模板 D .)另对 NA的纯度要求不高且多态性检出率高，验成本低。实

重复性和强度受几种参数的影响，括盐的浓度、包引物退火温度、模板浓度、引物的长度和顺序。P u等[用此技术对 al 9 f

22随机引物 P . CR的局限性*为通讯作者。

国家自然科学基金 (0 7 7 7 .南省杰出青年基金 .南省高校创新人才工程基金。 3 10 0 )河河

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《海畜牧兽医通讯》 2 0第 3期上 0 6年念珠菌属的分离菌进行分析，实验结果表明。同一菌种的不同菌型间呈现出 D A长度的多态性；带型图在同一菌种 N此的不同菌型问，相似程度远大于不同种的菌，其这也说明每种菌的随机引物 P R带型极具特征性。研究还发现， C同时使用几种引物比用一种引物所产生条带复杂，不易说明问且题。代敏等【 1该方法对 5们用 O株来自不同病人的幽门螺杆菌进行了基因分型，由此探讨了不同基因型别的幽门螺杆并

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行了分离、克隆和测序。从获得的代表 3 2个不同表达序列的克隆中，通过寄生虫生活周期不同阶段以及热提升刺激后的R T—P R方法的证实， C其中的 2 4个表达序列是差异表达基因。进一步分析表明， 9个克隆与已知基因序列有很高的同源性，其它大多数与数据库中基因序列无关，被确定为新的表达序列。

菌与疾病之间的关系。结果表明：O株幽门螺杆菌有不 …… 此处隐藏：7089字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……