金属螯合亲和色谱中的疏水作用

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第33卷分析化学(FENXIHUAXUE)　研究报告第10期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

2005

年10月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1376～1380

金属螯合亲和色谱中的疏水作用李　蓉

131,2　陈国亮　赵文明2

1(西安交通大学生命科学与技术学院,西安710049)　　2(西北大学化工学院,西安710069)

摘　要　通过考察盐溶盐和盐析盐浓度对蛋白质在IDA裸柱和金属螯合柱上保留行为的影响,详细研究了金属螯合色谱中的疏水作用,疏水作用的发生、形成的条件以及不同条件下对蛋白质保留值的贡献。实验结果表明,在高浓度和低浓度的盐溶盐以及低浓度盐析盐中,蛋白质在金属螯合柱上的保留主要受静电和配位作用控制,而疏水作用对蛋白质的保留影响很小。对弱亲和性的金属螯合柱以静电作用为主,其大小可用参数Q表征;对强亲和性的IDA2Cu(Ⅱ)柱以配位作用为主。仅在高浓度的盐析盐中,金属螯合柱才呈现较强的疏水作用,支配蛋白质保留。实验证明,金属螯合色谱中疏水作用主要来自固定相间隔臂中的疏水碳链和盐析盐对蛋白质的增疏作用,利用这种疏水作用有可能改善金属螯合色谱分离的选择性。

关键词　金属螯合亲和色谱,疏水作用,蛋白质

1　引　　言

[1](I)Porath等首先提出,该法是基于蛋白质

。与其它亲和色谱法相比,金属螯合色谱具有较高通用性、柱容量、柱寿命;色谱柱的制备与再生比较容易;在不同色谱条件下柱子具有多种分离功能

和分离纯化的重要工具[3][2];多数情况下蛋白质通过柱子仍保持生物活性,并且容易放大和工业化。由于上述特点,IMAC技术成为蛋白质识别。关于蛋白质在金属螯合色谱中的保留机理,蛋白质与固定金属间的相互作

[4]用以及影响这些作用的因素,相关文献已进行过讨论。这些作用力主要包括静电与配位作用,但很

[5]少涉及疏水作用。蛋白质在金属螯合色谱中的疏水作用现象,虽然早已发现,然而疏水作用产生原

因、形成的条件以及不同条件下对蛋白质保留的影响却未深入研究。搞清这些问题,对研究蛋白质在金属螯合色谱中保留机理,提高蛋白质分离的选择性,选择适宜的洗脱条件有重要作用。

2　实验部分

2.1　仪器与试剂

LG26A型高效液相色谱仪(日本岛津公司);匀浆装置(日本Chemico公司)。硅胶(粒度7μm,孔径30nm,北京化学试剂研究所);亚氨基二乙酸IDA,化学纯(湖州生物化学厂);γ2缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷GLDP(辽宁盖县化工研究所)。其它试剂均为分析纯(西安化学试剂厂)。水为二次蒸馏水。核糖核酸酶RNase、细胞色素C(Cyt2C)、溶菌酶Lys和超氧化物歧化酶SOD(美国Sigma公司)。浓度各为2g/L的标准蛋白混合液用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)配制。

2.2　色谱柱的制备

按文献[6]所述的方法,合成IDA阳离子交换柱。再以0.5mL/min流速泵入浓度0.05mol/L对应金属离子(pH5.0)直至饱和,分别用水和0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)充分洗去未结合的金属离子。更换金属离子时,用0.05mol/LEDTA除去原结合金属离子,水洗后再重复上述操作固定新的金属离子。GLDP2硅胶柱按文献[7]方法合成。

2.3　色谱实验

低浓度和高浓度盐溶盐(NaCl)以及高浓度盐析盐((NH4)2SO4和Na2SO4)对蛋白质保留行为的影响按文中各图表色谱条件进行。盐浓度与保留值的关系按等浓度洗脱方式进行,高浓度盐析盐对蛋白　2004210225收稿;2005201217接受

本文系陕西省科委资助项目(No.96H09)

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第10期李　蓉等:金属螯合亲和色谱中的疏水作用

　　1377质保留值影响按梯度洗脱,所有实验死时间均用0.1mol/LNaNO2测定。

3　结果与讨论

3.1　低浓度盐溶盐浓度对蛋白质保留值的影响

图1表示盐浓度C与蛋白质容量因子k′的关系。从图看出,NaCl浓度在0～0.5mol/L范围,蛋白质在弱结合金属螯合柱上的保留行为与IDA裸柱相似。随盐浓度的增加,蛋白质保留值减小,并且容量因子k′和盐浓度C的倒数互成对数线性关系。表明蛋白质与弱结合金属螯合柱间的作用具有阳离子交换的静电作用特征。蛋白质保留值之所以随盐浓度的增加而减小,是由于增加盐浓度吸附在固定

+相上的蛋白质与溶液中带正电荷的抗衡离子(Na)间的交换平衡向蛋白质解吸的方向进行。

如果用一个数学式表达图1中k′和C的关系,可给出下面的公式:lgk′=A+nlg(1/C)。式中截矩A是与流动相和固定相性质、相比以及金属螯合柱与蛋白质和抗衡离子亲和势有关的常数。斜率n

[5]是静电作用参数,它表示盐对蛋白质和固定相间静电作用的影响。表1中Q是图1

直线截矩和斜率[8]

图1　lgk′与()Fig.1　betwlgk′andlg(1/C)atlowconcentrationNaClsolution

流动相(mobilephase):0.02mol/LKH2PO4+xmol/LNaCl(pH6.0);流速(flowrate):1mL/min;检测器(detector):UV

(λ=280nm);进样量(sizeofsample):20μL;各蛋白浓度(concentrationofeachprotein):2g/L。

之和,在数值上等于盐浓度C=0.1mol/L时容量因子的对数。它表示金属螯合柱对蛋白质的净亲和能力,对在酸性介质中弱结合的金属螯合柱亦即静电作用的大小。通常Q越大,金属螯合柱与蛋白质间静电作用越强,蛋白质的保留时间越长。从表1看出:(1)所有被实验蛋白无论用IDA裸柱或弱结合的金属螯合柱,在低浓度NaCl的磷酸缓冲体系(pH6.0)测得的Q值,均随蛋白质等电点pI的增加而增大。这是因为,固定pH下,随pI的增加,蛋白质的正电性增大,与带相反电荷的离子交换基或金属螯合配体间静电作用增强;(2)在弱结合金属螯合柱上测得蛋白质的Q值均小于在IDA裸柱测定结果,表明表1　lgk′-lg(1/C)作图的斜率和截矩

Table1　Theslopesandinterceptsofplotsoflgk′vslg(1/C)

蛋白质

Proteins

RNase

Cyt2C

LyspI9.410.611.0IDAAnQAIDA2Ni(Ⅱ)nQAIDA2Zn(Ⅱ)nQAIDA2Co(Ⅱ)nQIDA2Cu(Ⅱ)-2.684.42-2.154.76-0.573.201.742.612.63-1.281.48-1.521.93-1.322.930.200.411.61-1.341.40-1.582.15-1.412.950.060.571.54-1.090.99-0.10不流出Noelution-1.301.49-1.242.250.191.01不流出Noelution不流出Noelution　3Q=A+n;IDA:iminodiaceticacid;RNase:ribonuclease;Cyt2C:cytochromeC;Lys:lysozyme

蛋白质对阳离子交换柱较金属螯合柱具有较强亲和力。这是由于在pH<7.0的酸性溶液中,蛋白质在金属螯合柱上的保留主要受静电作用控制。金属离子的插入,削弱了带正电离荷蛋白质与IDA酸根间

[4]的静电吸引力;(3)IDA2Cu(Ⅱ)是一种与蛋白质强结合的金属螯合柱,蛋白质在固定相上的保留主要

受较强的配位作用支配。因此用一般离子交换色谱常用的NaCl2KH2PO4缓冲体系不能将被吸附的蛋白从金属螯合柱洗脱,仅用竞争洗脱的方法可以被洗脱

3.2　高浓度盐溶盐浓度对蛋白质保留的影响[4]。

为了考察金属螯合柱在高浓度盐溶盐中的疏水性,在IDA裸柱、IDA2Ni(Ⅱ)、IDA2Zn(Ⅱ)和IDA2Cu(Ⅱ)柱上,分别采用0.50、0.75、1.00、1.25和1.50mol/LNaCl+0.02mol/LKH2PO4(pH6.0)作流动相,按等浓度洗脱方法研究了高浓度盐溶盐浓度变化对RNase、Cyt2C和Lys保留特性的影响,结果见图2。由图2看出,在高浓度NaCl的磷酸缓冲液中,蛋白质在IDA裸柱、IDA2Ni(Ⅱ)、IDA2Zn(Ⅱ)和

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　　1378分析化学第33

卷

图2　高浓度盐溶盐对蛋白质保留的影响Fig.2　Theinfluencesofhighconcentrationsalting-insaltonproteinretention3RNaseCyt2C和Lys在IDA …… 此处隐藏：8889字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……