实验二 植物总RNA提取

生物实验

植物总RNA提取及常见问题 植物总RNA提取及常见问题

生物实验

真核生物的基因组是DNA,为什么不直接 ， 真核生物的基因组是 得到我们需要的基因呢？ 从DNA PCR得到我们需要的基因呢？ 得到我们需要的基因呢

生物实验

真核生物与原核生物区别真核生物基因分布在多个染色体上，而原核生物只一个染色体。 真核生物基因分布在多个染色体上，而原核生物只一个染色体。 真核生物在基因组转录后的绝大部分前体RNA必须经过剪接过程 真核生物在基因组转录后的绝大部分前体RNA必须经过剪接过程 才能形成成熟的mRNA,而原核生物的基因几乎不需要转录后加工。 才能形成成熟的mRNA,而原核生物的基因几乎不需要转录后加工。 真核生物细胞中DNA与组蛋白和大量非组蛋白结合 真核生物细胞中DNA与组蛋白和大量非组蛋白结合，并有核膜将 与组蛋白和大量非组蛋白结合， 其与细胞质隔离， 其与细胞质隔离，结果真核细胞的转录和翻译在时间上和空间上都是 分离的，而原核细胞的基因转录和翻译是同步的。 分离的，而原核细胞的基因转录和翻译是同步的。 真核生物的基因是不连续的，中间存在不被翻译的内含子序列， 真核生物的基因是不连续的，中间存在不被翻译的内含子序列， 而原核生物几乎每一个基因都是完整的连续的DNA片段 片段。 而原核生物几乎每一个基因都是完整的连续的DNA片段。 真核生物基因组的复制起点多，缺少明显的操纵子结构， 真核生物基因组的复制起点多，缺少明显的操纵子结构，而原核 生物的基因组一般是一个复制子。 生物的基因组一般是一个复制子。

生物实验

PS DNA

外显子 S

PL

外显子 L

外显子 2

外显子 3

50b

2800bp

161bp

4500bp

205bp 327bp

初始转录本： 在唾腺中转录 成熟 mRNA: 1663nt 初始转录本： 在肝中转录 成熟 mRNA: 1773nt 图 18-57 小鼠淀粉酶(amy) 基因利用不同启动子产生两个不同的 mRNA

生物实验

所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基 所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基 克隆再表达， 因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通 因为获取的DNA里面会含有非编码区 里面会含有非编码区。 的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。要表达真 核生物的基因并表达出相应的蛋白， 核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其 mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。 mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。 这条颇费周折的途径

生物实验

在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库 在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获 文库、 等杂交实验 取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒 取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒 基因时，

会用到RNA提取和 -PCR技术 提取和RT 基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。

生物实验

cDNA文库的构建 文库的构建mRNA 反转录 cDNA (互补 互补DNA) 互补 第二条DNA链 链 第二条

生物实验

反转录人工合成互补DNA, cDNA 反转录人工合成互补构建基因文库获取目的 基因存在的问题—— 基因存在的问题—— 费时费事 内含子序列 反转录人工合成互补 DNA方法的优势 DNA方法的优势—— 方法的优势—— 获取的DNA片段往往是具 获取的DNA片段往往是具 有特定功能的目的基因

生物实验

RNA提取的通用方法 RNA提取的通用方法异硫氰酸胍/ 异硫氰酸胍/苯酚法原理： 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解， 性，核酸释放； 核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定 下溶解度的不同而分别位于整 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整 由于在特定pH 个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。

生物实验

步骤: 步骤: 材料准备：尽量新鲜。 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍(亚硫氢胍，巯基乙醇， 月桂肌氨酸等)。 裂解变性：异硫氰酸胍(亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等)。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA,有效抑制核酸酶。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA,有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70%乙醇。 洗涤：70%乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠(pH4.0):维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 ):维持变性的细胞裂解液的 乙酸钠(pH4.0):维持变性的细胞裂解液的pH值 沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。

生物实验

影响RNA提取的因素 影响RNA提取的因素材料： 材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料 新鲜， 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料 贮存在TRIzol或样品贮存液中， 贮存在TRIzol或样品贮存液中，于-70℃或-20℃保存 TRIzol或样品贮存液中 70℃或 20℃保存 如要多次提取，请分成多份保存 如要多次提取， 液氮长期保存，- ℃ 液氮长期保存，-70℃短期保存 ，-70

生物实验

样品破碎及裂解： 样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法： 根据不同材料选择不同的处

理方法：

培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 培养细胞： 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解， TRIzol可直接裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先 用酶或者机械方法破壁 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快 速，样品保持冷冻 样品量适当， 样品量适当，保证充分裂解 为减少DNA污染， 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量 污染

生物实验

纯化： 纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； 在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； 经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易 沉淀等，虽然经济，但操作时间长， 经典的纯化方法， 造成 RNA 降解； 降解； 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反 柱离心式纯化方法：抽提速度快， 应的杂质，是目前较为理想的选择。 应的杂质，是目前较为理想的选择。

生物实验

RNA提取的最大影响因素 提取的最大影响因素-RNA酶 提取的最大影响因素 酶在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失 实验中 败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而 败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶 的污染。由于RNA酶广泛存在而 稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，RNA酶催化 稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，RNA酶催化 的反应一般不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就 的反应一般不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的 制剂中只要存在少量的RN …… 此处隐藏：4061字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……