一种新型核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中的应用

现代预防医学2010年第37卷第19期ModernPreventiveMedicine，2010，Vol.37，NO.19

中图分类号：R394.3

文献标识码：A

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文章编号：1003-8507（2010）19-3717-03

【实验技术及其应用】

一种新型核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中的应用

常冰梅，张栋，李美宁，王惠珍，张悦红

摘要：［目的］比较两种核酸染料Goldviewna和溴化乙锭（EB）对琼脂糖凝胶中DNA的染色效果，并分析Gold-［方法］分别使用两种核酸染料对凝胶中

［结果］在紫外

viewna取代溴化乙锭（EB）用于常规琼脂糖凝胶电泳后核酸染色的可能性。

质粒DNA和PCR扩增片段进行染色，紫外凝胶成像仪下观察和记录结果，并对结果进行比较分析。

凝胶成像仪下，可观察到经两种方法染色的DNA条带清晰，亮度相当，两种染料对DNA染色结果无明显差异（P﹥

0.05）。

分析。

［结论］新型核酸染料Goldviewna是一种安全灵敏的核酸染料，能够代替EB，用于常规凝胶中的DNA染色和

关键词：核酸染色；溴化乙锭；Goldviewna

APPLICATIONOFTHENUCLEICACIDDYESTUFFINAGAROSEGELELECTROPHORESISCHANGBing-mei，ZHANGDong，LIMei-ning，etal.（Biochemistry&MolecularBiologyDepartmentofShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China）

Abstract：

［Objective］Tostainnucleicacidsbygoldviewnaandethidiumbromicle（EB），toinvestigatewhetherthe

goldviewnacouldsubstituteEBforroutinenucleicacidstaining.［Methods］DNAofplasmidandPCRfragmentswerestainedwithgoldviewnaandEB.ThestainingresultswereinvestigatedunderUVtransilluminator.［Results］UndertheUVtransillu-minator，DNAstripstainedbygoldviewnacouldbeseenwiththesamebrightnessasthosestainedbyEB.［Conclusion］Gold-viewnaisasafe，sensitivealternativetoEBforroutinenucleicacidstaining.

Keywords：Nucleicacidstaining；EthidiumBromide；Goldviewna

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离纯化和鉴定DNA片段的标准方法，属于生命科学研究领域的基本实验。该技术操作简便快速，当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（Ethidium

sigma公司产品，琼脂糖（Agarose），DNAMarker购自Takara

公司，含质粒转化菌株由我室冻存，其余试剂均为国产分析纯。PCR引物由上海生物工程研究所合成，该对引物可扩增该质粒DNA上一580bp片段。

bromide，EB）染色，在紫外光下至少可以检出1~10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。EB染

［1］

1.2主要仪器

料具有染色效果好、性质稳定、易储存、价格便宜和操作简便等优点．但其有一个缺点就是可诱发突变，具有潜在致癌性，且具有中等毒性，可能对操作人员造成危害和对环境造成污染。因此实验结束后，应对含EB的溶液及其污染物进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。现在研究人员正不断推出致突变性低、染色效果好的新染料，以期取代

［2］

DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）BIORADMolecu-larImagerGelDocXR170-8171型紫外凝胶成像仪（美国）。1.3方法1.3.1

碱裂解法提取质粒并进行质粒DNA纯度和浓度测定，参照文献［2］的方法小量提取质粒，取10μl质粒DNA用TE缓冲液稀释至1ml，混匀。以无DNA的TE为空白，测定样品在260nm和280nm波长下的光密度吸收值，每个样品重复3次，取3次结果的平均值作为最终结果，换算出OD260／方法如下：

EB。Goldviewna是一种近年推出的新型核酸染料，灵敏度与EB相似，使用方法也与EB相同，且不具致癌性。本研究证实在质粒DNA和PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳经EB和Goldviewna染色后灵敏度相当，能够满足常规凝胶中的DNA

染色分析的需求。

OD280的比值。根据双链DNA1OD260nm=50μg，计算出样品DNA的浓度，计算公式为所测的OD260nm×50／10（μg／μl）。1.3.2PCR扩增质粒中的一580bp的基因片段取5个灭菌

的0.5ml离心管中，分别加入ddH2015μl，10×PCRBuffer2

1材料和方法

1.1主要材料和试剂

Goldviewna染料购自北京博大泰克技术有限公司，EB为

基金项目：山西省科技攻关项目（20080311059-6）；山西医科大学科

技创新项目（01200713）

作者简介：常冰梅（1974-），女，博士，副教授，硕士生导师，研究

方向：肿瘤分子生物学

作者单位：山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，太原，030001

μl，模板DNA（50ng）1μl，dNTP（10mMeach），上、下游Primer（20μM），PfuDNA聚合酶（2.5U）各0.5μl，建立20μl反应体系。混匀，短暂离心．放在PCR仪上进行PCR反应。

反应条件：预变性95℃5min，94℃45s，55℃1min，72℃1

min，30循环。

1.3.3琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA及PCR扩增产物灌制两块浓度为1%琼脂糖凝胶，其一含溴化乙锭0.5μg／ml，另一凝胶中含有Goldviewna0.5μg／ml，将每个泳道按25ng的质粒

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DNA样品或50ngPCR产物上样于琼脂糖凝胶进行电泳分离，

电压70V，电泳时间为60min。

22.1

结果

紫外凝胶成像仪下直接观察

经琼脂糖凝胶电泳后，将两组凝胶板分别置于紫外凝胶成

1.3.4统计分析用凝胶电泳成像分析系统观察，并用分析软

件对质粒DNA及PCR基因扩增带光密度值进行定量。计量资料以±s表示，检验水准α＝0.05，利用SPSS12.0软件采用t检验进行统计分析。

像仪下，可观察到两组胶板中的DNA样品和DNAMarker条带清晰，其亮度相当，且宽度也相差不大，实验结果表明两种核酸染料的灵敏度大致相同，但Marker中250bp条带经EB染色比Goldviewna染色更清晰（见图1，2

）。

注：1，3，5，7，9为PCR扩增条带，2，4，6，8，10为质粒DNA样品，M：MarkerDNADL250bp

图1EB染色结果图2Goldviewna染色结果

2.2统计分析

琼脂糖凝胶电泳后经两种染色方法染色的质粒DNA和

离子基团，可以与核酸，蛋白质等多种阴离子基团非共价结合。在较低浓度时以及某种阳离子存在的条件下，优先与核酸的磷酸基团的结合。因此，最好使用新鲜的电泳缓冲液，以便电泳液及凝胶中的杂质减少，减少对荧光物质与核酸的结合的影响。

（3）在pH值3.6~7.0之间时，Goldviewna可与与核酸

（4）琼脂糖

加速结合，因此，最好使用新鲜的电泳缓冲液。

PCR扩增条带，其平均密度值经t检验，t＝2.058，P﹥0.05，差异无统计学意义，结果见表1。

1 DNA PCR

n !"" # 凝胶电泳过程中产生的温度升高，可能会影响荧光的强度，因此，凝胶电泳完毕后，可以在-20℃冰箱中放置2~3min后再

（5）由于Goldviewna产生的是绿色荧光.因此，不适和

（6）胶厚度不宜超过0.5cm，否则影响检测的灵

" #! $ % 观察。

用一般单色胶卷拍照留存，可以通过凝胶紫外成像系统保存在计算机中。

敏度。当样品蛋白杂质较多时，会影响荧光的亮度.加入Gold-

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