一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧

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一种用质粒

转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧陈洪栋董文博李红民以拓

西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室植物生物技术研究室西北大学生命科学学院,西安

摘

要,

目的是建立一种简化、实用的用质粗,

转化大肠杆菌的操作方法。用氛化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。采

以质粗

一

,

朽,

和植物双元表达载体

州田

分别转化用于质杜扩增与保存的常和花。质拉与感受态细胞的混合液

用大肠杆菌菌株

和

以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株

冰上作用一定时间后,直接涂布含有筛选扰生素的实用。

平板,于

℃培养

一

。结果表明,用不同大小的质拉

转化不同

的大肠杆菌菌株,都可以获得满足实脸要求,转化效率可高达关词。转化方法质杜

阳性克隆卜。该方法较标准的转化流程更加简便、省时、

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引官质粒成功转化大肠杆菌,

的液体培养基中于布选择性平板由等首次报道,此后,多位研究者对的条件如温度、子强度和种离,最

℃复培养恢

一

后涂细胞的标

。该方法被称为是

。

准转化方法,在世界范围内的分子生物学实验室中

影响质粒转化

广泛应用并不断被完善,最高转化效率可达护克隆单质粒质粒。然而,利用该方法完成,

类、质粒分子质量大小等进行了优化和改进终形成一致认可的转化程序暂热激一,冰浴

’细胞与

在℃短

对大肠杆菌的转化,至少需要约

抓化钙存在下于一℃用一定时间后于作一

对于一般的质粒转化实验而言,比较费时费力。文章作者尝试劝这一标准转化程序进行简化,获得

,随后在不含抗生素

收稿日期二玲一一羞金项目西安市科技局科技攻关项目以刀印作者简介陈洪栋一,女,硕士研究生,研究方向西北大学生命科学学院细胞生物学方向通讯作者李红民,卜口泛侧翰脚

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吐物孩术通报了比较满意的结果。

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材料与方法菌株和质粒两种扩增与

保存的大肠杆菌菌株菌种类型用于质粒和,用于

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藏中心惠赠、与食品研究所

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验室构建留存

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讨论在早期的基因组文库或遗传转化中,大量的研究致力文库的构建,高转化效率对于于提高转化的效率以满足部分实验研究的需要,如文库质量至关重要。伴随文库构建方法的发展和改进,质粒已经不再是文库构建当中唯一可选的载体分子。是,用质粒但转化。感受态细胞

抗性基因表达盒外,其他质。抗性基

粒均具有氨节青霉素因表达盒。

感受态细胞制备不同类型细胞的过夜培养液分别以胰蛋白脉,养基添加一的接种量转接至酵母提取物,琼脂糖于培养基中,固体培

℃荡培养至振以上,℃心收离,冰浴

一直是分子生物学实验室非常重要而且常规化的操作之一,特别是用于质粒载体的扩增与保存、基因克隆、表达载体构建以及质粒细胞间的转移。作者的研究表明,质粒与大肠杆菌感受态细胞冰浴作用一定时间后直接涂布选择性平板,可以获得足够高的转化效率。尽管转化效率最高可达少个单护一个单,较标准转化方法的效率低,甚至低于等建立的“在不同宿主

,收集菌液并冰浴

集菌体,重悬于上,℃离心收集菌体,重悬于质粒提取试剂盒行。调整质粒浓度至制备与转化,

以’

所有质粒均按照质粒说明书进与闪观,吸取

卜。闪质粒℃培养

闪感受态细胞混合,冰浴。印一混合液涂布选择性比平板,察抗性克隆的形成,统计实验结果。

￡转化方法”,但是利用作者建立的简化诫程序在较短的时间内获得的转化克隆的绝对数量对于后续操作已经足够。实际上,如果转化的目的只是为了质粒载体的扩增与保存、因克隆、达基表载体构建以及质粒在不同宿主细胞间的转的浓度移,热激和恢复培养完全可以省略。使用者可以根据自己

的目的和要求,通过调整质粒及其与感受态细胞冰上作用的时间以获得比较满意的转化效率。另外,因为操作步骤的减少,污染杂菌的风险也随之减少。但是,用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时,热激和随后的恢复性培养操作十分必要,否则大大影响实验结果。

结论文章作者用分子质量介于和

之间的各种质粒分别转化几种受试大肠杆菌细胞,缺省了标准转化程序中的操作。实验表明,所有质粒均可转化进人相应宿主细胞。结果显示,在缺省热激和恢复培养的转化操作中,质粒伴随冰浴时间延长,质粒转化效。当冰浴时间在而以上时

与感受图

态细胞作用的时间称为影响转化效率的重要因素。

笼显高明提,抗性克

隆的数量

有的可高达少个午

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