基于SPR技术的表皮生长因子受体与新疆紫草中4种活性成分的相互作(2)

　　运行缓冲液 （PBST） 由10 mmol·LNa3PO4和150 mmol·LNa Cl配制， 用HCl调节p H至7.4, 加入0.005%聚山梨醇酯20, 使用前经0.22μm微孔滤膜过滤。p H由德国Sartorius PB-10 p H计测定。实验用水为美国Millipore公司Milli-Q纯水系统提供的去离子水。

　　2 实验方法。

　　2.1 EGFR在芯片上的固定。

　　EGFR固定采用氨基偶联法[15].首先进行预吸附实验， 确定EGFR在芯片上的最佳固定条件。预实验步骤为在0.1 mL超纯水中加入EGFR 10μg, 使其充分溶解， 再用p H分别为4.0, 4.5, 5.0, 5.5的乙酸缓冲液稀释10倍。之后将不同p H的EGFR溶液分别同时注入芯片通道， 根据信号响应单位 （Response Unit, RU） 选取适宜的p H;在选定的p H下分别配制质量浓度为5, 10, 20 mg·L的EGFR溶液， 依据RU确定EGFR在芯片上的最佳结合浓度。设置流速25μL·min, 时间350 s.然后进行EGFR固定， 步骤如下， （1） 将0.05 mol·LSulso-NHS和0.2 mol·LEDC按1∶1混合后， 以25μL·min的流速流过传感芯片通道， 时间200 s; （2） 以预吸附实验确定的p H和浓度配制EGFR溶液， 使其与芯片上活化的羧基反应， 流速25μL·min, 时间200 s; （3） 用盐酸乙醇胺封闭残余活化的羧基， 流速25μL·min, 时间200 s; （4） 注入缓冲液， 除去非特异性吸附。另设第2个通道作为对照， 只进行活化和封闭而不标记EGFR.

　　2.2 样品配制。

　　实验所用左旋紫草素等4种物质均由含5%DMSO的运行缓冲液PBST配制。最高浓度均为0.5 mmol·L, 经2倍倍比稀释得5个浓度梯度。另设置一个只含有5%DMSO的PBST的溶液作为空白对照。

　　2.3 相互作用。

　　上述实验全部在25℃进行。待EGFR在芯片表面固定好之后， 同一单体的6种浓度系列同时以30μL·min的流速垂直流过EGFR固定通道并与其作用。实时采集响应信号， 结合时间为200 s, 解离200 s.

　　2.4 数据处理。

　　利用Proten On Manager 2.1.2软件进行动力学分析处理， 分别计算各单体与EGFR的结合速率常数ka, 解离速率常数kd和解离平衡常数KD等相关参数。

　　3 结果。

　　3.1 EGFR的固定。

　　以p H 4.5, 质量浓度10 mg·L作为EGFR最终的标记条件。图1显示了EGFR在芯片表面的动态固定曲线， 其固定量为250RU.该值较BSA等蛋白大大降低[15], 这可能与其本身的结构有关。但与文献[14]报道的EGFR固定量 （230 RU） 相比， 该方法的固定量明显提高。
 

　　3.2 EGFR与4种活性成分相互作用的动力学试验。

　　以EGFR为靶标， 利用SPR实时研究了它与新疆紫草中4种单体分子的相互作用。实验结果显示， 在4种单体分子中， β， β-二甲基丙烯酰紫草素与EGFR有较强的相互作用， 其余3种则没有明确响应 （结果没有显示） .图2显示了β， β-二甲基丙烯酰紫草素与EGFR的动态相互作用曲线。

 

　　3.3 动力学参数。

　　据Langmuir等温吸附模型， 假设芯片表面双分子反应遵循假一级反应动力学公式[16]:.其中， A为分析物；B为结合在芯片上的蛋白；AB为芯片表面的结合物；ka是吸附过程的结合速率常数；kd是脱附过程的解离速率常数。

　　该反应结合阶段的动力学方程可表示为：dR/dt=kaCRmax- （kaC+kd） R （1） R为结合物时间t的响应信号；dR/dt为结合物响应信号的变化速率；C为分析物浓度；Rmax为结合物的最大量。结合反应的解离平衡常数KD定义为KD=kd/ka （2） .根据公式， 利用Proten On Manager 2.1.2软件可计算出EGFR对β， β-二甲基丙烯酰紫草素相互作用的动力学参数， 分别为ka=1.27×10L·mol·s, kd=2.92×10s, KD=2.31×10mol·L, Rmax=51.3, 卡方值 （Chi） =3.25.因其他3种物质无明显的结合曲线， 很难拟合出它们的动力学数据。

　　KD反应了分子间结合能力的大小， KD越小， 表明结合力或亲和力越大。一般情况下， KD在10~10表明亲和力较强。由实验KD值可看出， EGFR与β， β-二甲基丙烯酰紫草素有很强的亲和力。Chi小于Rmax的10%, 在统计学中是可信的。

　　抑制剂对酶的抑制作用与它们之间的亲和性存在相关性[17].抑制剂与酶的亲和力越大， 结合就越牢固， 抑制作用也越强。结合的动力学性质实质反应了其生物活性。β， β-二甲基丙烯酰紫草素与EGFR有很强的亲和力， 揭示其可能为EGFR的一种抑制剂。

　　4 讨论。

　　4.1 EGFR固定条件的选择。

　　在EGFR固定前， 需要进行预吸附试验， 摸索适宜的标记条件。溶液的p H和浓度是影响蛋白标记量的最主要因素。

　　4.1.1 p H的影响。

　　采用质量浓度同为10 mg·L, 不同p H的EGFR进行预吸附试验。EGFR一般通过预先接在金膜表面的羧基进行连接。当蛋白带正电荷时更易吸附在羧基表面， 利于发生偶联反应， 所以一般选择EGFR溶液的p H小于其等电点。但当p H降到一定值时， 修饰表面的负电荷将起决定作用， 会导致吸附量降低。考虑到EGFR的等电点为5.6, 实验选择的p H分别为4.0, 4.5, 5.0, 5.5.实验发现EGFR在p H 4.5时吸附量最高， 表明p H过低或过高都不利于吸附。为此， 选择此条件作为EGFR溶液的p H.

　　4.1.2 浓度的影响。

　　增加EGFR的浓度会相应地增大固定量， 但浓度过高又会造成试剂浪费。最佳条件应是满足实验需求的最低EGFR浓度。实验进一步考察了p H 4.5时EGFR吸附量随质量浓度 （5, 10, 20 mg·L） 的变化。研究发现在起始阶段， 吸附量随EGFR浓度增大而增大， 而且吸附速率非常快；在质量浓度为10 mg·L时吸附量达到最大；但当EGFR达到20 mg·L后， 浓度虽然增大1倍而吸附量却呈下降状态。结合文献[15]和预吸附试验， 特别是考虑到分析物的相对分子质量<250 Da, 最终选择10 mg·L作为EGFR的标记浓度。 …… 此处隐藏：975字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……