基于SPR技术的表皮生长因子受体与新疆紫草中4种活性成分的相互作

基于SPR技术的表皮生长因子受体与新疆紫草中4种活性成分的相互作 本文关键词：紫草，受体，新疆，表皮，活性

基于SPR技术的表皮生长因子受体与新疆紫草中4种活性成分的相互作 本文简介：摘要：目的：以人表皮生长因子受体（EGFR）为靶标，从左旋紫草素，乙酰紫草素，β，β-二甲基丙烯酰紫草素，β-乙酰氧基异戊酰紫草素等新疆紫草所含的4种萘醌类活性成分中筛选潜在的EGFR抑制剂。方法：利用表面等离子体共振（SPR）技术，首先通过预吸附实验，优化固定的pH和

基于SPR技术的表皮生长因子受体与新疆紫草中4种活性成分的相互作 本文内容：

　　摘要：目的：以人表皮生长因子受体 （EGFR） 为靶标， 从左旋紫草素， 乙酰紫草素， β， β-二甲基丙烯酰紫草素， β-乙酰氧基异戊酰紫草素等新疆紫草所含的4种萘醌类活性成分中筛选潜在的EGFR抑制剂。方法：利用表面等离子体共振 （SPR） 技术， 首先通过预吸附实验， 优化固定的pH和浓度， 选择最佳条件， 构筑EGFR生物芯片。在此基础上， 以pH 7.4, 浓度10mmol·L-1的磷酸缓冲溶液 （含0.005%聚山梨醇酯-20） 作为相互作用时的缓冲溶液， 实时动态研究EGFR与4种单体的相互作用。通过软件计算动力学参数， 基于结合动力学常数大小， 筛选抑制剂。结果：选择pH 4.5, 10 mmol·L-1的乙酸缓冲液、含量为10 mg·L-1的EGFR为其最佳的固定条件， 最终固定量为250 RU.相互作用结果显示4种单体中， β， β-二甲基丙烯酰紫草素与EGFR有明显的结合作用， 其他3种单体无明确响应。动力学参数计算结果显示， EGFR与β， β-二甲基丙烯酰紫草素相互作用的结合速率常数ka为1.27×104 L·mol-1·s-1, 解离速率常数kd为2.92×10-2s-1, 解离平衡常数KD为2.31×10-6mol·L-1, 卡方值 （Chi2） 为3.25.KD<10-5mol·L-1, 表明他们有较强的亲和力。结论：β， β-二甲基丙烯酰紫草素可能为EGFR的一种抑制剂。

　　关键词：表皮生长因子受体； 新疆紫草； 表面等离子体共振技术； β， β-二甲基丙烯酰紫草素。

　　恶性肿瘤是当前威胁人类健康和生命的世界三大顽症之一。世界卫生组织 （WHO） 2014年发布的《世界癌症报告》中显示， 2012年全球新增癌症1410万例， 其中我国新增病例位居世界首位。预计未来20年内， 每年新增患者将多达2 398万[1].我国发布的《2015年中国肿瘤登记年报》中显示新增病例337.2万癌症， 癌症死亡221.3万， 位居发病死亡率首位[2].如何遏制肿瘤疾病的发展并有效降低其死亡率已成为医学界正面临的严重挑战之一。

　　解决该问题的策略之一是研发高效的抗肿瘤药物。在众多类型中， 以蛋白酶为靶标的分子靶向药物因具有特异性强、耐药性低、毒副反应低等优点而异军突起， 已成为抗肿瘤药物研发的主要方向[3-4].当前70%以上的分子靶向药物是以酪氨酸蛋白激酶为靶标的抑制剂[2].

　　表皮生长因子受体 （Epidermal growth factor receptor, EGFR） 作为受体酪氨酸激酶家族的一种常见的跨膜蛋白， 广泛分布于哺乳动物的上皮细胞。现代医学研究表明， 许多实体肿瘤的发生、发展、愈后不良等与EGFR的过量表达密切相关， 阻断EGFR信号转导则能有效的抑制肿瘤的生长[5], 它是分子靶向药物研究的重要靶点之一[2,6].

　　天然产物中蕴含丰富的类型多样的活性成分， 是新药发现的源头和基础。从植物中发现或筛选新型高效的酶抑制活性物质一直是众多医药研究者孜孜以求的目标[7].近年来药理学研究发现， 我国特色民族药材新疆紫草Arnebia euchroma能明显降低EGFR及酪氨酸激酶水平， 抑制多种肿瘤细胞生长增殖[8-9], 可能存在酪氨酸激酶抑制剂成分。

　　目前， 有关新疆紫草抗肿瘤作用的研究多集中于新疆紫草粗提物细胞实验[10-11], 而对于其各种单体成分的抗肿瘤靶向分子研究则较少。因此， 进一步研究新疆紫草中的单体组分与EGFR的相互作用， 探索筛选其中酶抑制剂成分， 对于新型抗肿瘤靶向药物的研发具有重要意义。

　　酶抑制剂筛选方法主要分为细胞筛选和生化测定筛选两大类。相对于前者， 生化测定筛选方法因具有快速简单有效等优点， 得到了广泛应用[7,12].生化测定筛选方法主要包括光谱法， 色谱法， 质谱法， 表面等离子体共振 （Surface Plasmon Resonance, SPR） 等。其中SPR技术作为近年来药物高通量筛选方法， 具有免标记， 实时， 快速等优点， 可以从大量化合物中快速筛选出与酶有较大结合力的潜在的酶抑制剂， 比传统药物筛选方法省时、省钱和省力[13].许多研究者利用SPR技术开展了药物筛选相关研究。如邓宏伟等[14]研究了小分子NSC51186与EGFR的相互作用。笔者基于SPR技术， 研究了血清白蛋白与色氨酸对映异构体的手性识别相互作用[15].

　　本文以EGFR为靶标分子， 构筑EGFR生物芯片， 研究了其与新疆紫草中萘醌类色素化合物的4种单体活性成分， 左旋紫草素， β， β-二甲基丙烯酰紫草素， 乙酰紫草素及β-乙酰氧基异戊酰紫草素的相互作用， 从中筛选出了与EGFR有较强结合力的β， β-二甲基丙烯酰紫草素。相关研究可为新型抗肿瘤分子靶向药物的研究提供参考。

　　1 材料。

　　Proten On XPR36型生物分子相互作用系统；GLH型传感芯片氨基偶联试剂盒 （批号8800630） , 包括N-羟基硫代琥珀酰亚胺 （Sulfo-NHS） , N-乙基-N'- （二甲氨基丙基） 碳二亚胺 （EDC） , 1 mol·L盐酸乙醇胺 （p H 8.5） ;固定化缓冲试剂盒 （批号8800503） , 包括4种浓度为10 mmol·L, p H分别为4.0, 4.5, 5.0, 5.5的乙酸缓冲液；芯片再生试剂盒 （批号8801160） 包括0.5%SDS, 50 mmol·LNa OH, 100 mmol·LHCl, 以上试剂均购自美国BioRad公司。人EGFR （批号029K4078） 购自美国Sigma公司。新疆紫草的4种单体， 包括左旋紫草素， β， β-二甲基丙烯酰紫草素， 乙酰紫草素及β-乙酰氧基异戊酰紫草素由实验室分离提取制备， 纯度≥95%, 结构经NMR和MS确证。其余分析纯试剂购自北京化学试剂公司。 …… 此处隐藏：1116字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……