微生物设计实验报告

南昌大学实验报告

学生姓名： 叶落不晓 学 号： 6002212025 专业班级： 给排水121班 实验类型：√ 验证□ 综合□ 设计□ 创新 实验日期：2014-12-02～09 实验成绩：

水处理微生物学实验实验设计：

水体中总大肠菌群的检验

一、实验目的和要求

1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术；

2、通过大肠杆菌群的测定，了解大肠杆菌群的生化特性； 3、学习使用大肠菌群检数表； 3

二、实验基本原理

群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（Most Probable Number），简称MPN表示。

如果接种的水样量不是10mL、1mL和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值：

MPN值 MPN指数

10(mL)

接种量最大的一管

(mL)

大肠菌群数系指每升水样中所含有的有大肠菌群的数目。大肠菌数一般包括大肠埃希氏杆菌、产气杆菌、枸椽酸杆菌和副大肠杆菌。本实验的发酵试验采用含有乳糖的培养基，测定结果不包括副大肠杆菌。

我国现行生活饮用水卫生标准GB 5749-85规定：细菌总数1mL水中不得超过100个，大肠菌群1L水中不得超过3个。

三、主要仪器设备及耗材

1、器材

高压蒸气灭菌器、干热灭菌箱、恒温培养箱、显微镜、镜油、二甲苯、酒精灯、镍络丝接种棒、载玻片若干、锥形瓶若干、试管架、洗耳球、记号笔、吹风机、培养皿（8×100mm）、试管（16×150mm）、移液管（10×1mL、2×10mL）、烧杯若干等

2、试剂

脱水的乳糖蛋白胨培养基 、磷酸氢二钾、琼脂、蛋白胨、邻酸二氢钾、乳糖、结晶紫染液、番红染液、碘液、95％乙醇、5％孔雀绿染液、0.5％番红水染液等

四、实验步骤

2014-12-02 9：30 实验准备、复发酵

1、仪器准备

a、 培养皿的包装：再用旧报纸将八个培养

b、移液管的包装： 将打包好的玻璃器皿放入干热灭菌箱内进行灭菌2.5个小时以上。

2、试剂准备

a、普通浓度乳糖蛋白胨培养液：将9g脱水的乳糖蛋白胨培养基加入煮沸的100ml水中，充分搅拌混匀。

b、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：将27g脱水的乳糖蛋白胨培养基加入煮沸的100ml水中，充分搅拌混匀。

c、品红亚硫酸钠培养基（远藤式培养基）：

于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀，定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于冷暗处备用。

d、伊红美蓝培养基（EMB）：

于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解。再家

人2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。

3、初发酵实验初步准备

a、取11支干净的试管（内有倒管）分别加入10ml普通浓度乳糖蛋白胨培养基。其中10支试管为自备水用，另1支试管为备用试管；

b、取5支干净的试管（内有倒管）分别加入5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液。

将16支试管加塞，捆成两捆，用旧报纸包扎好，用记号笔注明组号，放入高压蒸汽锅内进行湿热灭菌。

4、清洁实验室

1、 a、于5支装有5ml三倍浓度乳糖发酵管（内有倒管）内各注入10ml自备水样。（共5管，需水样50ml）

b、于5支装有10ml普通浓度乳糖发酵管（内有倒管）内各注入1ml原水样。（共5管，需水样5ml）

c、于5支装有10ml普通浓度乳糖发酵管（内有倒管）内各注入0.1ml 水样（或先将水样1:10稀释，接种1ml稀释水样）。（共5管，需原水样0.5ml）

d、备用试管中接种含大肠杆菌的试液1ml。

以上操作需在酒精灯下进行无菌操作，所用移液管均为已杀菌的移液管。总用自备水量为55.5ml。置于37℃恒温箱中培养24～48h。

2、清洁实验室

2014-12-06 9:30 初发酵结果、平板划线

1、实验结果

初发酵实验取用润田矿泉水样的15支试管均未变色，即紫色，一部分表现为无气体和酸产生，为阴性反应，表示为无大肠杆菌群存在；一部分表现为有气体形成，但没有产酸，溶液也不浑浊，可能原因是操作不规范等技术原因引起；另一支接种了大肠杆菌的试管产生了较多的气泡，由原先的紫色变成了黄色，证明产酸产气，为大肠杆菌群阳性。（其他组选用的池塘水、寝室饮用水均产酸产气，说明都含有大肠菌群的存在。）

2、倒平板、平板划线

a、取出原先配置好的远藤式培养基，水浴溶解成液体

b、将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

c、右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰；

d、用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20ml）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀。

e、等待平板冷却凝固（约5min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。

3、平板划线

ab、在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞；

c、将试管口通过火焰，将已冷却的接种环伸入产酸产气的菌液中，沾取一环菌液，将试管口通过火焰，并塞上棉塞；

f、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；

g、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三区域内划线。注意不要将最后一区域的划线与第一区相连。

h、划线好后，将平板倒置，并用记号笔写上组号及所接种的菌样。 每种产酸产气的菌液接种两个培养皿中，没有产酸产气组的借用其他产酸产气组的菌液操作。划线好后放入37℃恒温培养箱中培养24h。

4、 清洁实验室

2014-12-07 14:30 划线结果观察、复发酵

1、划线结果观察

本组 品红亚硫酸钠培养基上：一部分菌落显示为紫红色，具有金属光泽；还有一部分菌落略带金属光泽，中心色较深。

其他组 伊红美蓝培养基上：一部分菌落显示为深紫黑色，有金属光泽；另一部分菌落为紫黑色，略带金属光泽、中心色较深。

2、革兰氏染色镜检

a

b、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 c、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。

d、染色：结晶紫染色约1min--水洗--碘液媒染1min后--水洗--酒精脱色15-20秒--水洗--番红复染色2-3min--水洗--干燥—置于油镜下观察，阴性无芽胞杆菌者为红色，阳性者为紫色。

3、复发酵试验

上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h。

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