1 株紫色非硫光合细菌的分离鉴定

1 株紫色非硫光合细菌的分离鉴定

1株紫色非硫光合细菌的分离鉴定

1,2221*2*刘芳,王敏,杨慧,孙军德,高俊莲

(1.沈阳农业大学,辽宁沈阳110161;2.北京农业生物技术研究中心,北京100097)

摘要 [目的]为紫色非硫光合细菌的应用研究打下基础。[方法]从杭州养鱼塘水样和底泥样品中分离纯化到1株紫色非硫光合细菌菌株,通过对其细胞形态观察、活细胞色素吸收光谱测定及生理生化特征研究等进行分类鉴定。[结果]HZ-1菌株可在光照厌氧或黑暗好氧条件下生长;菌体呈短杆状,稍弯,为革兰氏阴性菌株;含有细菌叶绿素a和类胡萝卜素;接触酶试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验阳性,硫化氢生成试验、明胶液化试验阴性。[结论]通过对分离纯化的紫色非硫光合细菌菌株的分类鉴定,判断菌株HZ-1为沼泽红假单胞菌。

关键词 紫色非硫光合细菌;分离鉴定;菌株

中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)18-07538-02

IsolationandIdentificationonAStrainofPurpleNon-SulfurPhotosyntheticBacteriaLIUFangetal (ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning110161)Abstract [Objective]Theresearchaimedtoprovideabasisfortheapplicationofpurplenon-sulfurphotosyntheticbacteria.[Method]Astrainpurplenon-sulfurphotosyntheticbacteriawasisolatedandpurifiedfromthewatersampleandsedimentoffishpondofHangzhou.Theclassificationandidentifica-tionofpurplenon-sulfurphotosyntheticbacteriawascarriedoutbytheobservationofcellmorphology,thecellcoloringmatterabsorptionspectrumdetermi-nationandthestudyofphysiologicalandbiochemicalcharacteristics.[Results]TheHZ-1straincouldgrowundertheconditionofilluminatedanaerobicordarkaerobic.Thestrainwasgramnegativeandthecellofthestrainwasintheshapeofshortandslightlycurvedrod.Thecellscontainedbacteriachloro-phyllaandlike-carotene.Thecontactenzymetest,indoleproductiontestandnitratereductiontestwaspositivereactionandthehydrogensulfideformationtestandgelatinliquefactiontestwasnegtivereaction.[Conclusion]TheHZ-1strainwasidentifiedasRhodopseudomonaspalusterisbytheclassificationandidentificationofpurplenon-sulfurphotosyntheticbacteria.Keywords Purplenon-sulfurphotosyntheticbacteria;Isolationandidentification;Strain

紫色非硫光合细菌(PurpleNon-SulfurBacteria,简称PNSB),也称红螺菌科光合细菌,是一类在厌氧条件下进行不放氧光合作用的特殊菌群,广泛存在于自然界中的水田、江河、湖沼、海洋、池塘、活性污泥和土壤等环境中。紫色非硫光合细菌以光作为能源,利用自然界中有机物如硫化氢、氨等作为供氢体而进行光合作用[1],其在畜禽养殖、水产养殖、农作物种植以及污水治理等方面都有很好的应用价值[2]。利用紫色非硫光合细菌处理养殖场水体,进而净化水质是现在水体生物处理中的一个新难点和技术热点。笔者从杭州养鱼塘水样和底泥样品中分离纯化到1株紫色非硫光合细菌菌株,并通过对其细胞形态观察、活细胞色素吸收光谱的测定和生理生化特征等方面的分类鉴定,为紫色非硫光合细菌的应用研究打下基础。1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 仪器:重庆光学仪器厂的COIC普通光学显微镜;UV722型紫外可见分光光度计;BiometraT1Thermocy-clerPCR仪;LNICAM(英国)仪器有限公司的双光束扫描型紫外/可见分光光度计。试剂:天根生化科技(北京)有限公司离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒;16SrDNA扩增所用引物为细菌通用引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;北京美莱博医学科技有限公司的2×PCRTaqMix;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 样品与培养基 用于筛选菌株的样品采自杭州市西湖区龙王沙村养鸡场水与底泥。所用培养基有3种。①富集用培养基:NH4C11.0g,CH3COONa3.5g,MgCl20.1g,CaCl20.1g,KHPO0.6g,KHPO0.4g,酵母膏0.1g,水1000ml,pH值

基金项目 辽宁省重点实验室科研项目(20060751)。

作者简介 刘芳(1980-),女,辽宁铁岭人,硕士研究生,研究方向:微

生物资源。*通讯作者。

收稿日期 2008-04-28

7.2[3]。②分离用培养基:KH2PO40.33g,MgSO4 7H2O0.33g,NaCl0.33g,NH4Cl0.5g,CaCl2 2H2O0.05g,丁二酸钠1.0g,酵母粉0.02g,蒸馏水1L,pH值6.8～7.2。高压蒸汽灭菌后,加入无机盐溶液1.0ml,0.02%FeSO4 7H2O溶液0.5ml。③半固体培养基:KH2PO40.33g,MgSO4 7H2O0.33g,NaCl0.33g,NH4Cl0.5g,CaCl2 2H2O0.05g,丁二酸钠1.0g,酵母粉0.02g,琼脂6g,蒸馏水1L,pH值6.8～7.2。高压蒸汽灭菌后,加入无机盐溶液1.0ml,0.02%FeSO4 7H2O溶液0.5ml。无机盐溶液配方为:ZnSO4 7H2O10mg,MnCl2 4H2O3mg,H3BO330mg,CoCl2 6H2O20mg,CuCl2 2H2O1mg,NiCl2 6H2O2mg,Na2MoO43mg,蒸馏水1.0L,pH值3～4。1.3 紫色非硫光合细菌的富集与分离纯化

1.3.1 紫色非硫光合细菌富集。以18mm×180mm试管作为厌氧培养容器,装入15ml的富集用液体培养基,接入采集的水样1ml及底泥样品少量,振荡混匀,用灭菌液体石蜡封口,塞上橡胶塞,用封口膜密封瓶塞,放入光照培养箱中,在光照强度2000～3000lx,30℃培养7～10d,直至培养液显现红色至棕红色,用吸管取lml富集培养液转接至另一装有新鲜培养液的试管中,重复以上操作4～5次,此时所得即为紫色非硫光合细菌群。

1.3.2 紫色非硫光合细菌分离纯化。取1ml紫色非硫光合细菌群的培养液作梯度稀释,分别取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66个稀释度的菌悬液接种于半固体分离培养基上,充分混匀,用灭菌的液体石蜡封口,塞上橡胶塞,封口膜封口,光照2000～3000lx,30℃培养7～10d,至试管中出现单菌落。

1.3.3 固体双层平板培养法纯化光合细菌。挑取试管中的单菌落,在分离培养基的平板上划线,再在上面倒一层融化的固体培养基,造成厌氧环境,用封口膜封口,光照2000～3000lx,30℃培养7～10d,反复挑取单菌落,镜检检测,保存

1 株紫色非硫光合细菌的分离鉴定

纯培养菌株。

1.4 紫色非硫光合细菌的鉴定

1.4.1 菌落形态观察。将挑选的菌株接于分离培养基平板,培养7～10d,观察其菌落形态。

1.4.2 活细胞吸收光谱测定。取适量光照厌氧纯培养物在10000r/min离心2min,生理盐水洗涤,悬浮于60%(W/W)的蔗糖水溶液中,在波长350～900nm扫描,记录其光吸收峰值[5]。

1.4.3 生理生化特性测定。该菌株的生理生化特性鉴定参

16SrDNA片断条带单一,经测序得到长度约为1.4kb的16SrDNA序列。将此序列用BLAST软件和MEGA软件处理,并与GenBank中已发表的16SrDNA序列进行同源性比较,选取同源性为95%以上的多株细菌,并以红螺菌属标准株Rho-dospirillumrubrumATCCl1170为外群,构建系统发育树(见图2)。由系统发育树可知,菌株HZ-1与已报导的红假单胞菌属的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalusteris)标准株ATCCl7001亲源关系最近,有99.0%的相似性,并聚成一簇。同时根据菌株的生理生态学特性,可确定分离的HZ-1菌

株照《常见细菌系统鉴定手册》[6]进行,其中有接触酶试验、H2S

生成试验、吲哚试验、硝酸样还原试验、明胶液化试验和淀粉水解试验。根据文献[7]鉴定种。1.5 16SrDNA基因分析

1.5.1 细菌16SrDNA序列分析。提取该菌株的基因组DNA[8],以基因组DNA为模板,进行16SrDNA序列扩增。正向引物fD1:5′-AGAGTTTGATCCTTGGCTCAG-3′,反向引物rp2:5′-ACG …… 此处隐藏：4303字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……