分子生物学在检验医学中的应用

分子生物学在检验医学中的应用

一、分子生物学在检验医学中 的常用技术 1、 2、 3、 4、 5、 6、 PCR技术 RT-PCR技术 RFLP SSCP MSP 测序

二、外源性疾病的检验与诊断： 1、 细菌、支原体、衣原体、寄生虫、 病毒等 2、 SARS冠状病毒的分子生物学检测

BNIoutS/BNoutAs:sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C FraGment lenGth 195 bp

BNIinS/BNIAs: sense GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG antisense CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G Fragment length 110 bp

SAR1s/SAR1as: sense CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA antisense TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG Fragment length 150 bp

Amplicon sequence (BNI-1, Bernhard-Nocht Institute, Hamburg, Germany)

TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAA TTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCG CGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGC TTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTG TGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACA GGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGA CACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAA AACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC

SARS-specific primers: Cor-p-F2 (+) 5'CTAACATGCTTAGGATAATGG 3', Cor-p-F3 (+) 5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3', Cor-p-R1 (-) 5'CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3', Product size: Cor-p-F2/Cor-p-R1 :368 bp Cor-p-F3/Cor-p-R1 :348 bp

Government Virus Unit 9/F Public Health Laboratory Centre 382 NAm Cheong Street Shek Kip Mei Kowloon, Hong Kong SAR Hong Kong - SAR China COR-1,COR-2: sense 5' CAC CGT TTC TAC AGG TTA GCT AAC GA 3' antisense 5' AAA TGT TTA CGC AGG TAA GCG TAA AA 3'

Product size: 310 bp

Queen Mary Hospital The University of Hong Kong University Pathology Building Hong Kong - SAR ChinaHKU: sense 5' TACACACCTCAGCGTTG 3' antisense 5' CACGAACGTGACGAAT 3' Product size 182 bps

二、内源性疾病的检验与诊断：

1、 临床基因变异酶的分子性质研究 1) 用PCR-SSCP技术发现我国第一例 LDH遗传变异病例

病例 21岁男性： LDH:75 U/L (参考范围：110-240 U/L) 其余指标均正常 在三年的调查期间，LDH活力始终 处于较低水平，在 48-85 U/L之间

经排除其它原因，如血中的抑 制剂的存在、药物的影响等可能因 素 外，我们怀疑可能有遗传性的 LDH变异。根据计算红细胞中H、 M亚基的比值，初步断定为H亚基 变异，采用合成的7对引物，分别 扩增LDH基因中的7个外显子，然 后用SSCP电泳法与正常人对照， 发现变异发生在外显子4上，由此 证明该病人的长期低酶活力是有基 因变异引起的。

2n 2 3n 3 4n 4

5n 5 6n 6

2) LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及对检验结果的影响基因变异可导致酶分子组成结构发生 变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成 影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall), 因为在不同疾病状态下，从相关联的组织 器官中释放出的酶与预期的不同，病人血 清酶活力不能完全反映各种疾病的状态， 容易造成

误诊。

LDH-A基因变异类型_________________________________________________ 变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响 —————————————————————————

A-171 CGA-TGA A-328 GAG-TAG A-81 GAC-AAC A-220 AAA-GAA A-314 CGT-TGT A-20 插入C A-128 TGTTGT-TGT A-213 丢失2 bp (CT) A-251 丢失20 bp

Arg-Ter Glu-Ter Asp-Asn Lys-Glu Arg-Cys

无义突变 无义突变 外显子2丢失 电荷变化 电荷变化 移码突变 ValVal-Val 辅酶结合 移码突变 移码突变

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LDH-B基因变异类型变异位置 B-6 B-35 B-103 B-131 B-139 B-145 B-147 B-171 B-172 B-173 B-176 B-287 B-320 DNA 氨基酸置换 AAA-GAA Lys-Gly GCC-GAG Ala-Glu 8bp重复 AGT-CGT Ser-Arg 丢失2 bp (TC) 4bp重复 TAT-TAG Tyr-Ter CGC-CCC Arg-Pro TTT-GTT Phe-Val CGC-CAC Arg-His ATG-TTG Met-Leu 丢失1bp(C) GAT-GTT Asp-Val 影 响 电荷变化 辅酶结合 移码突变 辅酶结合 移码突变 移码突变 无义突变 基质结合 基质结合 P轴的安定性 分子稳定性 移码突变 电荷变化

3) CK变异的分子性质及对酶活力 的影响 病例56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科 心电图和临床症状提示AMI 实验室检查： LDH 6900 U/L (200-400 U/L) LDH-1/LDH-2 1.72 CK 37 U/L (15-130 U/L) CK-MB 0 U/L

RT-PCR结果