质粒DNA限制性酶切图谱分析(2)

DNA的限制性酶切实验原理质粒DNA限制性酶切图谱分析„ 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶都是从原核生物中发现,它们的功能犹似高等功物的免疫系统, 用于抗击外来DNA的侵袭。„ 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键, 产生的DNA片段5’端为P,3’端为OH。

四、操作步骤1、质粒DNA的限制性酶切反应 (1)、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号,用微量移液枪分别加入DNA 5μl, 10×缓冲液2μl,BSA 2ul,EcoRI 1ul, ddH2O 10ul,用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。

(2)、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上 (如插在泡沫塑料板上),37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。 (3)、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。

DNA的限制性酶切实验原理质粒DNA限制性酶切图谱分析„ 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶都是从原核生物中发现,它们的功能犹似高等功物的免疫系统, 用于抗击外来DNA的侵袭。„ 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键, 产生的DNA片段5’端为P,3’端为OH。

2、琼脂糖凝胶电泳 (1)称取0.25g琼脂糖，置25ml电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解； (2)待溶液冷至60℃,加入2ul SYBR Green I。 (3)在距离胶模底板0.5-1mm处放置电泳梳，将琼脂糖溶液倒入胶模中，厚度约3-5mm,注意避免产生气泡； (4)凝胶完全凝固后，移去梳子和挡板，将凝胶放入电泳槽。加入 TAE缓冲液使恰好没过胶面约1mm; (5)将DNA样品与1/6体积加样缓冲液混合后，加入样品槽中； (6)接通电源，使样品槽在负极端，用80V的电压，至溴酚蓝到胶前沿时，停止电泳。 (7)凝胶自动处理系统(UVP)观察和拍照，记录结果。样品：DNA5ul、6X点样液2 ul,电极缓冲液5ul pUC118、pEGFP、 pUC118/ EcoRI、 pEGFP/ EcoRI、细菌基因组DNA DNA Marker实验结果：分析酶切图谱 (2ul,6X点样液2 ul,电极缓冲液

DNA的限制性酶切实验原理质粒DNA限制性酶切图谱分析„ 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶都是从原核生物中发现,它们的功能犹似高等功物的免疫系统, 用于抗击外来DNA的侵袭。„ 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键, 产生的DNA片段5’端为P,3’端为OH。

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