DGGE术在土壤微生物分子生态学研究中的应用(2)

２０５１６５种

［４］

，ＳＳＵｒＤＮＡ序列片段中存在着若干高

ｒＤＮＡ基因在细菌基因组上的多拷贝数使从ＤＧＧＥ

图谱的多样性评估复杂化，而ｒｐｏＢ基因在细菌基因组上为单拷贝，其ＤＧＧＥ图谱能够更易于分析［１０］。

冯炘以能够以呋喃丹为惟一碳源和氮源生长

保守区和高可变区碱基序列，它携带着物种的系统发育地位信息，不同的物种具有不同的ＳＳＵｒＤＮＡ序列，这些序列可用来作为区分生物系统进化的遗

２００６年第５期

周琳等：ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术在土壤微生物分子生态学研究中的应用

６９

的假单胞菌ＡＥＢＬ３作为生物强化菌对模拟呋喃丹污染的土壤环境进行了生物修复试验，１６Ｓ

（Ｆ９８４ＧＣ－Ｒ１０５７）可变区核苷酸探针，分别与等量的来自于克隆和细菌纯培养物的１６ＳｒＤＮＡ进行杂交，鉴定转基因马铃薯根围土壤样品群落指纹图中与分离到的菌株相对应的条带

［１４］

ｒＤＮＡ

扩增产物的变性梯度电泳结果揭示了生物修复过程中土壤微生物菌群结构的动态变化［１１］。任馨在实验室条件下通过秸杆还土试验，比较了转苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因（ｃｒｙ）水稻中ｃｒｙ基因表达最高期，秸杆和同一时期亲本稻秸杆的添加对水淹土壤可培养厌氧细菌数量和细菌群落组成的影响。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ指纹图谱和主成份分析（ＰＣＡ）结果表明，两种秸杆处理土壤细菌群落结构在培养的第

。由此，对于

ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ电泳胶上重要的条带（如高丰度条带

或与某种环境因素变化相关的条带）可以采用标记方法与克隆文库或已知纯菌ＤＮＡ进行杂交，从而确定该条带所对应的微生物的分类地位。这对于土壤中不能培养的重要微生物的分析鉴定具有重要意义。

３周和第５周达到显著性差异，随着培养时间的延

长，两种秸杆处理土壤间细菌群落结构的差异逐渐减小，到培养的第１１周差异基本消失［１２］。卜元卿等模拟稻秸原位还田条件，对１６ＳｒＤＮＡＶ３可变区扩增产物进行ＤＧＧＥ分析，结果说明稻秸能够增加土壤细菌多样性，随着培养期的延长，施有稻秸的处理中土壤细菌群落多态性的变化远远复杂于对照土壤；同时发现在稻秸刺激下，不同土壤类型的细菌群落多态性高峰期出现时间不同［１３］。

以上研究表明ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ可以反映不同生境中或同一生境不同时段、不同处理下微生物群落的差异与变迁，从而分析环境条件、生物修复、秸杆还土等因素对土壤微生物的影响；同时也可结合相应类型的ＰＣＲ对群落组成成员进行量化分析。利用除１６ＳｒＤＮＡ外的、在某些微生物范围内具有一定变异性的单拷贝基因（如ｒｐｏＢ基因等）为对象进行ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ分析，可以有效降低指纹图谱的复杂度，便于分析。

２．３ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ结合克隆测序及种系分

析对土壤样品进行研究

随着土壤微生物分子生态学研究的不断深入，

ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ与克隆测序及种系分析相结合，

对土壤样品进行研究，推动了土壤微生物分子生态学的进一步发展。该技术的一种方法是首先进行特定类群的保守基因的ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ凝胶电泳克隆建库和测序，从分析，对于目的条带进行回收、

而对环境中的重要微生物种群或受外界影响而显著变化的种群进行鉴定，监测它们的变化；另外一种方法是直接以ＰＣＲ产物建立克隆文库，然后将各克隆再以ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ引物扩增后，与环境样品扩增产物一起进行ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ电泳，根据电泳位置将样品中所有条带与特定的克隆一一对应，从而达到鉴定样品中条带的目的。

Ｋｏｗａｌｃｈｕｋ等采用嵌套式ＰＣＲ策略扩增得到５＇端携带ＧＣ夹的５６９ｂｐ的１８ＳｒＤＮＡ片段，对此

片段进行变性梯度凝胶电泳分析并进行克隆建库、测序和系统分类分析，鉴定了侵染滨草（Ａｍｍｏｐｈｉｌａ

２．２

标记技术与ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ结合对土壤样品

进行研究

ａｒｅｎａｒｉａ）的真菌种类主要为担子菌门和子囊菌门

的真菌［１５］，从而为滨草的防护提供了可靠准确的理论指导。Ｅｌｓａｓ等采用真菌特异性引物分析了经含有二苯并噻吩的石油处理的、随后接种了真菌哈茨木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）和少孢节丛孢菌（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）的土壤样品中的真菌群落，ＰＣＲ－ＤＧＧＥ结果表明，随着时间的延长，二苯并噻吩处理过的土壤中，一些特异真菌的量不断累积，而未经过处理的对照土壤却没有反映出这种趋势；经过克隆测序分析，经过处理过的土壤中含量不断提高的条带均为丛赤壳属的甘薯根腐病菌

ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ还可以与标记技术联合使用，其

技术流程是首先提取微生物环境样品的总ＤＮＡ，

ＰＣＲ扩增特定类群的保守基因，扩增产物进行ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ凝胶电泳分析，以从ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ图

谱上回收的条带为原始模板，制备带有标记的核苷酸探针，再与来自于已知纯培养物的相应基因扩增产物进行杂交，来确定ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ图谱上的特定条带的微生物种类，使ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ的技术更加完善。如，Ｈｅｕｅｒ等以ＴＧＧＥ图谱上回收的条带为原始模板，制备带有地高辛标记的１６ＳｒＤＮＡＶ６～Ｖ８

７０生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ

２００６年第５期

（Ｎｅｃｔｒｉａｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）和镰孢属的茄病镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ）的近缘种；而在培养基上菌落数增加的却为木霉属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）

和柱孢属

（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）［１６］。Ｇｏｍｅｓ等对热带种植的两个玉米品种的土壤和根际样品进行分析，在玉米的整个生长阶段都观察到了根圈效应，同时在不同的生长阶段真菌群落组成有明显的改变，但两个玉米品种间的真菌指纹图谱没有明显差异；在玉米幼苗期根际主要的真菌种群为子囊菌目的格孢腔亚目，而在成熟植株和衰老植株的则为子囊菌和担子菌酵母真菌

［１７］

是研究土壤微生物群落结构的一种可行方法［２０］。

综上所述，ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ结合克隆测序及种系分析对土壤样品进行研究可以明确土壤样品中微生物群落的总体组成结构、具体成员的分类地位及相互之间的亲缘关系、种群动态变化，便于从整体上全面地分析，较传统培养法可提供更多、更全面、更准确的信息。此外，ＲＴ－ＰＣＲ－ＤＧＧＥ可以反映出土壤微生物群落在转录水平上的状况，能够进一步推测具体组成成员代谢活性的情况。总之，该方法在明确土壤中微生物组成以及动态变化的具体信息的同时，也对实际问题的诊断、作物生长跟踪监测、根际效应以及秸秆还田等农事操作都具有重要理论和实用价值。

更为重要的是，ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ图谱分析及克隆测序分析需要适宜的和强有力的生物信息学方法来分析和处理，以使结果更加清晰、明确和数字化，增加其可信度和提高实用性。目前使用较为广泛的主成分析方法包括聚类分析（Ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ）［１８￣２１］、分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）［１２，２２，２３］、多维等级分析（Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｃａｌｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ，< …… 此处隐藏：2447字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……