产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究

论文

Vol.6　No.4第6卷　第4期生命科学研究

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Dec.2002

2002年12月LifeScienceResearch

产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究

程海娜,莫湘涛,陈　宇,谭海滨,周　雄,夏立秋

(湖南师范大学生命科学学院微生物学系,中国湖南长沙　410081)

Ξ

摘　要:通过初筛和复筛,得到一株产植酸酶较高的黑曲霉AN00101菌株,并对该菌种的产酶条件进行了研究.结果表明:配制加水量为35%的麸皮固体培养基,在37℃培养114h,用3%CaCl2进行提取,每g固体发酵

44物酶活高达1.3×10IU.经L9(3)正交实验表明,硫酸铵和硫酸镁对产酶有显著的促进作用,适宜添加量分别

为4%和0.3%.

关键词:植酸酶;黑曲霉;筛选;产酶条件

中图分类号:Q936　　　　　　　　　　　文献标识码:A

文章编号:100727847(2002)0420343204

StudiesonScreeningofCHENGHai2,MOXiang2tao,CHENYu,TANHai2bing,ZHOUXiong,XIALi2qiu

(DepartmentofMicrobiologyofLifeScienceCollege,HunanNormalUniversity,Changsha410081,Hunan,China)

Abstract:Aspergillusnigersecretingphytasewasseparatedbyscreeningandrescreening,andtheconditionsofpro2ducingphytasewasinvestigated.Theresultsshow:whenA.nigeriscultivatedat37℃for114hoursinwheatbransolidmediumadded35percentrunningwater,andphytasewasextractedby3percentchloridecalciumsolution,thehighestenzymeactivitywasobtained1.3×10IUineverygramfermentedproduct.Moreoveritisbetterforproduc2ingphytasetoadd4percentammoniumsulfateand0.3percentmagneiumsulfatetomedium.Keywords:phytase;Aspergillusniger;screening;conditionsofproducingphytase

(LifeScienceResearch,2002,6(4):343～346)

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　　植酸酶(phytase,EC3.1.3.8)是催化植酸及其盐类水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称.植酸酶添加在饲料中,将其中的植酸水解成肌醇和磷酸,提高了磷的利用率,降低了粪便中磷的排放量,减少了植酸磷对环境的污染.更为重要的是,植酸酶可使植酸盐蛋白质络合物降解而提高蛋白质的利用率,减少植酸盐对微量元素的螯合,提高植物饲

料的营养价值

[1～4]

.此外,植酸酶制剂在食品、医

药等方面有广泛的应用.但目前植酸酶制剂价格

昂贵,无法推广到饲料工业中,本研究的目的是筛选出植酸酶高产菌株,丰富植酸酶基因资源,以利于构建植酸酶基因工程菌,为大规模发酵生产廉

[5,6]

价的植酸酶制剂奠定基础.

Ξ收稿日期:2002208223;修回日期:2002211215

基金项目:国家创新基金项目(OOC26214300645)

作者简介:程海娜(19762),女,河南邓州人,硕士研究生,从事植酸酶分子生物学等方面的研究;莫湘涛(19672),男,湖南湘潭人,湖南师范大学讲师,从事微生物分子生物学等方面的研究;陈宇(19722),女,贵州安顺人,湖南师范大学讲师,从事微生物分子生物学等方面的研究;夏立秋(19552),男,湖南安乡人,湖南师范大学教授,硕士生导师,通讯作者,主要从事微生物分子和酶工程研究.

论文

　　　　　　　　　　　　　　生　命　科　学　研　究　　　　　　　　　　　　　　　　2002年3441　材料和方法1.1　材料1.1.1　培养基

的植酸酶量,用IU表示.2　结果和讨论

2.1　产植酸酶菌株的筛选

筛选培养基(%):植酸钙0.1,葡萄糖3,NH4NO30.5,KCI0.05,MgSO4 7HO20.05,MnSO4 7HO20.003,FeSO4 7HO20.003,琼脂1.8,pH5.7.

由于植酸钙的螯合作用,使培养基形成白色混浊,产植酸酶的菌株则会水解植酸钙,在菌落的周围形成透明圈,根据透明圈的有无和大小,可以初步判断该菌是否产植酸酶及酶活的高低.90余株菌中筛选出41株菌产植酸酶,其中真菌25株,细菌16株.从中选取20株透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株进行液体发酵.测定发酵液酶活,结果表明有13株菌酶活超过10IUΠml,其中,一株黑曲霉AN00101的酶活最高,达到171IUΠ

ml.

此培养基用于筛选真菌,牛肉膏蛋白胨培养基加0.1%的植酸钙用于筛选细菌.

液体发酵培养基:60g麸皮加入到935ml水中,再加入5gNaOH,在121℃处理20min后,用8层纱布过滤.所得滤液加入(1gper100ml):(NH4)2SO40.04、MgSO4 7HO20.02、casitone1、KH2PO40.05、K2HPO40.04,细菌培养基的pH为6.5,真菌培养基的pH为5.7.

固体发酵培养基:麸皮按试验设计加水灭菌即是.1.1.2　试剂

植酸钙Π合液:250ml(100gΠL)+250ml钒酸铵(2.35gΠL)+165ml65%硝酸+335ml水.1.2　方法1.2.1　产植酸酶菌株的初筛

将从土壤分离及本实验室所保藏的共90余株菌点接于筛选培养基上,在30℃培养3d.对有透明圈的进行重复筛选.1.2.2　产植酸酶菌株的复筛挑取产透明圈菌株接种于液体发酵培养基中,30℃摇振培养4d后,6000rΠmin离心20min,得粗酶液,测酶活.1.2.3　产植酸酶菌株的固体发酵

挑取菌株接种于固体发酵培养基中,在30℃培养3～6d,每天翻动一次.采用文献[7]方法抽提,得粗酶液,测酶活.1.2.4　酶活力测定

粗酶液进行适当稀释后,取0.2ml加入0.6mlpH5.50.25molΠL乙酸缓冲液,在37℃保温5min后加入8.4gΠL植酸钠1.6ml,继续保温30min,加入颜色Π终点混合液1.6ml,415nm测定无机磷含量.对照:在0.2ml酶液加入0.6ml乙酸缓冲液后,再加入1.6ml颜色Π终点混合液,最后加入底物.

植酸酶活性单位定义:在37℃pH5.5的条件下,每分钟从底物释放1纳摩尔无机磷所需要

图1　黑曲酶AN00101在含植酸钙平板上形成透明水解圈

Fig.1　ThehydrolysisboundresultbyA.nigerAN01001inplatecontainingcalciumphytase

2.2　产酶条件的研究

固体发酵与液体发酵相比,具有设备较简单、成本低、酶产量高和易于投产等优点,所以产酶条件的研究注重于对固体发酵的研究.2.2.1　培养基最适加水量的确定培养基中水分含量对菌体的生长及酶的产生都有很大影响,水分含量太少不利于菌的生长,太多不利于代谢产物的积累.在250ml三角瓶中装入10g麸皮,再加入不同体积的自来水,使加水量占总质量的30%～70%,每相差5%为一个处理,在30℃培养4d,测酶活.

从图2中可以看出培养基中加水量在35%时,测得的酶活最高,低于35%菌体生长缓慢;高于35%菌体虽生长很好,但测得的酶活较低,加水量为70%的酶活只是35%的酶活24.5%,原因可能是加水量低于35%时,培养基的水活度偏低,菌体延缓期延长,生长缓慢;加水量过多,对数生长期延长,不利于代谢产物积累.这与其它文献

论文

第4期　　　　　　　　　　　程海娜等:产植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究　　　　　　　　　　　　345报道的培养基的最佳含水率比较结果偏低,主要是因为没有把麸皮中的含水量计算在内

.

2.2.2　发酵时间对产酶的影响

在250ml三角瓶中,每瓶装15g固体发酵培养基,从72h开始每隔6h测一瓶培养物的酶活.从图3中可以看出在90～120h酶活都比较高,在114h时酶活最高,84h以前产酶量较低.2.2.3　不同培养温度对产酶的影响

配制相同的麸皮培养基3瓶,分别在30℃、33℃和37℃培养.结果发现在37℃时产酶最高,30℃和33℃分别是37℃酶活的89.5%和

图2　培养基加水量对AN00101产植酸酶的影响

Fig.2　Effectofwateraddedtomediumonproducing

phytase

96.8%.

2.2.4　不同pH的提取液对酶收率的影响

配制pH为5 …… 此处隐藏：3804字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……