shRNA详细原理及引物设计

shRNA原理

shRNA 克隆原理及引物设计

一．DNAoligo设计

1.来源：1）文献报道（优先考虑）

2）网站

利用网站提供的软件设计DNAoligo：

主要使用网站有3个, 老师认为不同算法得到重合的序列比较可靠, 故三者应综合使用 网站:

举例：HEXIM1shRNA设计

A: siDirect

输入accession number, 点”retrieve sequence”, 得到完整序列. 或直接输入序列

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设置只要将"contiguous sequences to avoid-A's or T's" 选上, 如图下

点design siRNA

结果: 页面一次只显示100个碱基(如1-100), 需要点击所需段来查看

优先选择“Effective, Both strand”, 但“Effective, Plus strand”也可用 显示的序列23个碱基, 应去头尾各2个, 取中间19位碱基

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B: Dharmacon

输入accession number, step 4中选blast, database选human 点”design siRNAs”

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结果: 优先选择score高, mismatch为3或大于3, 且不要化学修饰的序列

C: Ambion

序列可由SiDirect或其他位置粘贴过来,

设置中选中”4. Sequence constraints to avoid: 4 or more A's or T's in a row”, 点submit

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结果: 本网站生成的序列全部以AA开头, 后19位为所要序列

最终结果

完全重合很难实现, 所以也接受小部分不重合. 举例: 得到以下结果,

1. TT CAACAGCTGGGCAAGTTTA AG

1619

AA CAGCTGGGCAAGTTTAA GG 1622

Matched by SiDirect, Dharmacon (1619) and Ambion (1622)

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然后随便选择一段, CAACAGCTGGGCAAGTTTA (起点1621) 或CAGCTGGGCAAGTTTAAGG (1624)均可 标注为”sh+基因+起点” 如: shPRKD1-2616

注：由于所设计的每个oligo并不都具有knockdown效果，针对每个protein

设计oligo时，一般设计4-5个不同的oligo序列以便筛选。

2．shRNA设计model

shRNA design Model

A. New pSUPER-BX and pSR-H1 shRNA design model: BamHI-XhoI site

sh F: 5’

3’

sh R: 5’

3’

Example:

shCdk2-85 F: GGTGGTGGCGCTTAAGAAA R:TTTCTTAAGCGCCACCACC

shCdk2-85

shCdk2-85

B. Old pSUPER shRNA design model: BglII-HindIII site

sh

sh

Example:

shCdk2-85 F:GGTGGTGGCGCTTAAGAAA R:TTTCTTAAGCGCCACCACC

shCdk2-85

shCdk2-85

二．合成后DNAoligo的溶解

1）DNAoligo溶解前， 13000rpm离心3min。（由于合成的DNAoligo为粉末状态，且管内处于真空状态）

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2）用经高压灭菌后的ddH2O将DNAoligo定量至3μg/μl。 ddH2O的体积(V/μl)=DNAoligo的质量（mg）×1000／3 注：所取ddH2O的体积尽量准确。

3）常温放置30min，使DNAoligo充分溶解。

三．DNAoligo的退火 1）退火体系（50μl） 正向DNAoligo（F）: 1μl

反向DNAoligo（R）: 1μl 10×退火Buffer ： 5μl ddH2O ： 43μl

2）用石蜡膜将EP管口封好。

3）将EP管放入事先煮沸的电磁锅中，煮沸4min。

4）关闭电源，将电磁锅放入泡沫箱中保温。（为使温度缓慢下降，以便正反向oligo充分退火）

5）待锅中的水温降至常温，将EP管取出进行连接实验或置于-20℃冰箱中保存。

四．pSR-H1载体的XhoⅠ和BamHⅠ双酶切 1）酶切体系（50μl）

pSR-H1质粒： 5μg XhoⅠ（NEB） ： 2μl BamHⅠ（NEB） ： 2μl BamHⅠBuffer: 5μl BSA(100×) : 0.5μl ddH2O : 35.5μl

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2)混匀，用离心机将液体甩入管底。

3）37℃恒温水浴锅中反应过夜（至少12h，否则可能酶切不完全）。

五．酶切产物的胶回收（GE胶回收试剂盒） 1）电泳：配制1%的琼脂糖凝胶，150V电泳45min.

2)切胶：用吸水纸将凝胶上的电泳液吸干，干净的刀片在紫外灯下切出目的条带（胶块尽可能小）。

3）称量：将切好的胶块放入1.5ml的EP管中，称其重量并做好标记。

4）溶胶：用枪头将胶块搅碎，按100mg加100μl的capture buffer type 2的比例向EP管中加入capture buffer type 2，于60℃水浴中放置10min，期间颠倒离心管3次使胶块充分溶解。

5）离心：将溶胶液转至事先准备好的柱子中，放置3min，6000rpm离心1min。

6)洗涤：向柱子中加入500μl Wash Buffer，6000rpm离心1min。 7）洗脱：将柱子套置干净的离心管中，向中央加入15μlddH2O，13000rpm离心1min，收集流出液。 8）重复步骤7. 9）-20℃保存，待用。

六．酶切后的pSR-H1和退火oligo的体外连接