(一)立项依据与研究内容(4000-8000字)：

（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：

1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）

肝癌是高度恶性的肿瘤之一，患者死亡率高，我国每年死于肝癌的患者占全世界肝癌死亡人数的一半左右。广西是全国肝癌高发区之一，其肝癌死亡率是全国同类肿瘤发病死亡平均值的2倍左右。耐药性是肝癌难以治愈和患者死亡率高的关键原因之一。因此，肝癌耐药性的研究对我区乃至我国肝癌的治疗具有重要意义。

迄今为止，对肝癌等癌症耐药性的研究主要集中在癌细胞自身，其耐药机制主要包括：癌细胞对药物的降解、癌细胞特殊膜蛋白对药物的排除、药物作用靶点质和量的改变、DNA的自我修复，以及癌细胞分泌物对组织液中耐药蛋白的保护等[1-4]。最近的研究还表明，癌症产生耐药性的一个重要原因很可能是存在于肿瘤微环境中的健康细胞尤其淋巴细胞给癌细胞提供了相应的条件，使它能抵抗药物并存活下来[5, 6]。研究人员发现，那些对独立培养的癌细胞有效的药物却对与健康细胞共同培养的癌细胞无明显效果，这说明癌细胞会利用周围环境中的健康细胞来抵抗药物。他们还发现，相邻健康细胞分泌的一种叫做肝细胞生长因子的蛋白与黑色素瘤(一种恶性肿瘤)的耐药性相关，该蛋白目前正被作为药物作用靶点用于黑色素瘤治疗药物的开发研究。

环境变化会引起DNA上5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethyl- cytosine，5hmC）

位点的改变，从而引起细胞功能的异常。癌症发生使相邻细胞的生活环境发生明显的改变，这种改变也可能使相邻细胞DNA上5hmC位点发生改变，并进而影响这些修饰位点所在基因的活性和细胞的某些功能[7, 8]。DNA羟甲基化是最近三年来表观遗传学领域研究的新热点，是一种复制后表观遗传修饰，是Tet（Ten-eleven-translocation，10-11易位)蛋白催化5-甲基胞嘧啶（5-methyl- cytosine，5mC）形成5hmC的结果[9, 10]。5hmC的研究由于2009年Tet蛋白这一催化功能的发现而倍受关注[7-11]。5hmC被称为DNA的第6种碱基，它不仅参与DNA去甲基化过程，还具有激活和维持基因表达的作用，在原始生殖细胞、受精卵和干细胞重编程及干细胞多能性的维持等方面也起着重要的作用[7-9, 11-14]。在基因组水平上，5hmC在不同细胞具有不同的稳定表达图谱，在癌组织中5hmC则大量丢失[8, 15]。因此，5hmC在DNA上的分布可提供基因表达调控方面的功能信息，检测5hmC水平和分布，可望成为有价值的癌症诊断和预测手段。

虽然国内外DNA羟甲基化的研究已经倍受关注并取得了一定的进展，但这些研究还主要集中在人和哺乳动物的干细胞、原始生殖细胞、受精卵、神经组织、胚胎组织及癌细胞等病理组织细胞，肝癌等癌症耐药机制方面的研究则多从癌细胞本身的角度进行[8, 9, 12]，本课题组之前也从蛋白、基因和mRNA的角度对肝癌等癌症进行了大量研究[16-27]，但从肝内淋巴细胞分泌蛋白及其基因羟甲基化角度对肝癌耐药机制的研究还未见报道。因此，本立项拟以此作为研究的科学问题，通过研究肝内淋巴细胞分泌的肝细胞癌（最主要的肝癌类型）耐药相关蛋白、该蛋白基因5hmC位点的变化及后者对前者表达的影响和进一步对肝细胞癌耐药性的影响来探讨肝细胞癌的耐药机制。由于肝内淋巴细胞提高癌细胞耐药性的能力既可能是肝内淋巴细胞固有的，也可能是癌细胞诱导获得的，或二者兼而有之，

又由于基因的表达或沉默与基因上5hmC的存在与否及存在位置有着密切的相关性，因此我们推测，肝内淋巴细胞提高癌细胞耐药性可能是通过耐药相关蛋白（目标蛋白）基因正常羟甲基化来调控基因活性、从而分泌目标蛋白来完成的，也可能是通过癌细胞或其分泌物诱导引起肝内淋巴细胞内目标蛋白基因5hmC位点改变、从而引起目标蛋白基因表达和目标蛋白分泌异常来实现的，或二者协同完成的（图1）。我们将在本立项中以此推测作为科学假设，并通过一系列实验对之进行验证。

据此，本立项拟以与癌细胞共同培养的肝内淋巴细胞为研究对象，通过细胞培养、双向电泳、羟甲基化DNA免疫共沉淀（Hydroxymethylated DNA immunoprecipitation，hMeDIP）、逆转录PCR（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、DNA印迹（Southern blot）、DNA测序、串联质谱等技术，分离、纯化、鉴定肝内淋巴细胞分泌的肝细胞癌耐药相关蛋白，分析其mRNA表达、其基因5hmC位点变化及二者与耐药蛋白表达的关系，在蛋白、mRNA、基因等层次，从肝内淋巴细胞分泌蛋白及该类蛋白基因羟甲基化等角度探讨肝细胞癌耐药机制，为肝细胞癌的药物治疗提供理论依据和作用靶点。

图1 基于相邻淋巴细胞5hmC的肝细胞癌可能耐药途径

Figure 1. The supposed escape routes of liver cancer cells based on 5hmC in the

neighbouring lymphocytes

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