超氧化物歧化酶活性的测定

第３４卷第４期２０１２年１２月湖北大学学报（自然科学版）

（）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ　　　　Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．４　

，Ｄｅｃ．２０１２　

（）文章编号：１０００２３７５２０１２０４０３７３０５－－－

超氧化物歧化酶活性的测定

２

，史竞艳１，罗辛茹１，鲍江鸿１，赵子德１，黄丹１，向乾坤１

（）武汉生物工程学院化学与环境工程系，湖北武汉４湖北大学化学化工学院，湖北武汉４１．３０４１５；２．３００６２

摘要　主要采用光谱法研究测定超氧化物歧化酶（活性及不同实验条件对其活性的影响，找出最优ＳＯＤ）为实际工作提供一些有意义的指导，并且为下一步的酶促反应动力学研究提供实验和理论依据．的测活条件，

　·实验结果表明，测定Ｓ实验温度为２Ｈ值为ＯＤ活性的最优条件为：５℃，０．１ｍｏｌＬ－１Ｔｒｉｓｌ缓冲溶液，－ＨＣｐ　··内含２．邻苯三酚浓度为２．控制酶的加入量为０．８．２０，０ｍｍｏｌＬ－１ＥＤＴＡ，５ｍｍｏｌＬ－１，３０ｍＬ．

；邻苯三酚自氧化；活性；测定ＳＯＤ）　　关键词　超氧化物歧化酶（

６４２．３；Ｑ５５４　　　文献标志码　Ａ　　　　中图分类号　Ｏ

·为底物的金属酶，超氧化物歧化酶（是一种以超氧阴离子Ｏ能催化超氧自由基发生歧化反ＳＯＤ）２

１］

·－的天然消除剂，·－的毒性、应，是机体内Ｏ对机体细胞起保护作用，在防御Ｏ抗衰老［以及预防肿瘤２２］［］２３－

和抗炎［等方面起着重要的生理作用．自１９６９年ＭｃＣｏｒｄ和Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ４首次从牛红细胞中分离出超氧化物歧化酶以来，陆续在各种不同的生物组织都分离纯化出Ｓ并对Ｓ化学、药理、临ＯＤ，ＯＤ的物理、５］床和作用机理等方面进行了广泛研究，建立了多种活力测定方法［其中采用较多的是邻苯三酚法，这．

－

种方法具有操作简单、快速、试剂便宜且用量小、重复性好等优点，但文献报道的邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶活性的测定条件各不相同，而且研究的影响因素不够全面，这就造成了测定结果的混乱和缺乏为此我们对邻苯三酚自氧化法测定Ｓ探讨测活体系中缓冲可比性，ＯＤ活性的实验条件进行详细研究，溶液的ｐ温度、所含Ｅ邻苯三酚的浓度以及ＳＨ值、ＤＴＡ的浓度、ＯＤ酶浓度等因素对测定结果的影响，找出邻苯三酚测定超氧化物歧化酶活性的最优条件，其结果可对实际工作起到一定的指导作用，也可为进一步的酶促反应动力学研究提供实验和理论依据．

１　实验部分

，，，牛血Ｓ活力为３三羟甲基氨基甲烷（盐酸（开１．１　试剂与仪器　试剂：ＯＤ（９８％，０００Ｕ）Ｔｒｉｓ９９．９％）　

，，封东大化工有限公司）乙二胺四乙酸二钠（天津市风船化学试剂科技有限公司）ＥＤＴＡ－Ｎａ９９．０％，２，，邻苯三酚（贵州遵义佳宏化工有限责任公司）均为国产分析纯试剂，水为二次蒸馏水．

仪器：ＳＰ１９２０ＵＶ系列双光束紫外－可见分光光度计，３Ｅ型数字酸度计，电子天平ＨＳ－－ｐ

（），恒温水槽（ＢＳＡ１２４ＳＳＹＰ．－Ⅱ）

（·（·溶液的配制如下．溶液：准确称取１）０．１ｍｏｌＬ－１Ｔｒｉｓｌ０ｍｍｏｌＬ－１ＥＤＴＡ）Ｈ＝８．２０含２．－ＨＣｐ溶于水中，用稀盐酸调ｐ定１２．１１４ｇ三羟甲基氨基甲烷和０．７４４５ｇ乙二胺四乙酸二钠，２０，Ｈ值至８．　

（）·：·（准确移取１容至１０００ｍＬ；２０．０１ｍｏｌＬ－１ＨＣｌ０ｍＬ１ｍｏｌＬ－１的ＨＣｌ溶液稀释至１０００ｍＬ；３）６　　　

··准确称取０．用０．并定容于２ｍｍｏｌＬ－１邻苯三酚溶液：１８９２ｇ邻苯三酚，０１ｍｏｌＬ－１ＨＣｌ溶解，５０ｍＬ棕　

（）·色容量瓶中，于４℃冰箱中保存，使用时可稀释；用微量进样器准确移取１４４μｍＬ－１ＳＯＤ溶液：００ｇ　

·所有溶液的配制均采用二次蒸馏水．Ｌ，１ｍｍＬ－１ＳＯＤ原液于２５ｍＬ容量瓶中定容．ｇμ

·－）发生歧化反应生成Ｈ２Ｏ１．２　实验原理　超氧化物歧化酶是一种能催化超氧阴离子（Ｏ２和Ｏ２的金２

收稿日期：２０１２０５２８－－

））基金项目：湖北省教育厅科研基金（及武汉市教育局科研基金（资助Ｂ２００９４００６２００８Ｋ０１６

，：作者简介：史竞艳（女，博士，讲师，１９７９Ｅ－ｍａｉｌｓｈｉｉｎａｎ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ－）ｊｇｙ

３７４　

－

湖北大学学报（自然科学版）第３４卷

·＋２属酶，反应如下：２ＯＨ＋→Ｏ２＋Ｈ２Ｏ２．２

在碱性条件下，邻苯三酚可在羟基Ｈ＋发生离解时与溶液中的溶解氧发生反应生成半醌自由基，并

－

·氧化成具有强吸收的醌，产生Ｏ然后半醌自由基可进一步被Ｏ如下式所示：２；２

－

ＯＨ

Ｈ帨帨·Ｏ

Ｈ

＋Ｏ２�仭�＋

ＯＨ－

師師

Ｈ帨帨·Ｏ

Ｈ帨帨·－一经产生即被Ｓ如果溶液中含有Ｓ则Ｏ半醌自由基不能形成具有ＯＤ，ＯＤ歧化生成Ｈ２Ｏ２和Ｏ２，２

强吸收的醌，检测到的吸收强度将比无Ｓ且减弱的程度与Ｓ依据此ＯＤ时减弱，ＯＤ的浓度或活性有关，原理可对ＳＯＤ的活性进行测定．

按照表１所示的加样量加入试管中，于２１．３　实验方法　邻苯三酚自氧化速率的测定：５℃恒温水浴槽

··，准确移取０．对照管用０．中恒温２０ｍｉｎ后，３０ｍＬ的２．５ｍｍｏｌＬ－１邻苯三酚（０１ｍｏｌＬ－１ＨＣｌ代替）立即混匀，迅速倒入比色池中，在波长为３２０ｎｍ下采用紫外－可见分光计对邻苯三酚自氧化中间产物进，，扫描间隔为１ｓ扫描５ｍ记录该扫描曲线斜率即为邻苯三酚的自氧化速率Δ每次测行时间扫描，ｉｎＡ０，

定重复２～３次，确保实验结果的准确性和重现性．加入邻苯三酚前，先加入一定量Ｓ并减少同体ＳＯＤ活性的测定：ＳＯＤ活性测定法按上述操作，ＯＤ，

其他操作均与上述相同，每次实验重复２～３次，记录该曲线的斜率即为Δ邻苯三积二次蒸馏水，ＡＳＯＤ．／抑制率＝（酚自氧化的抑制率定义为：Ａ０－ΔＡＳＯＤ）Ａ０×１００％．ΔΔ

表１　邻苯三酚自氧化速率测定加样表试剂

·（·内含２．Ｈ＝８．２０，０．１ｍｏｌＬ－１Ｔｒｉｓｌ０ｍｍｏｌＬ－１ＥＤＴＡ）－ＨＣｐ

二次蒸馏水

·ＬＨＣｌ１０ｍｍｏｌ　

－１·２．５ｍｍｏｌＬ邻苯三酚

－１　

总体积

２　结果与讨论

但在２．１　邻苯三酚自氧化中最大吸收波长的选择　邻苯三酚自氧化产物在特定波长处有灵敏吸收峰，

具体应用中，测定波长的选择存在较大差异，主要

［］［］有４为了准确测定其最大吸２０ｎｍ６和３２５ｎｍ７．

收峰位置，对邻苯三酚自氧化过程在不同时间进行光谱扫描，扫描波长范围为２其结００～７００ｎｍ，果见图１．由图可看出，在反应一开始时即在３２０ｎｍ处出现了最大吸收峰，４２０ｎｍ处基本无吸收峰出现．随自氧化反应的不断进行，反应中间产物在不断积累，３２０ｎｍ处峰的吸收强度不断增加，主要是由于自氧 …… 此处隐藏：5306字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……