分子生物学实验常见问题分析及对策

分子生物学实验常见问题分析及对策-14

1、Southern杂交技术成败主要取决于哪两个因素？

答：Southern杂交技术的成败主要取决于两个因素：首先，用于探针的DNA纯度要高，否则影响特异性。其次是探针DNA的放射性比强度要高，因为增加放射性强，可提高检测水平。

2、Southern杂交技术中的DNA的消化和电泳有哪些注意点？

答：①选择的限制性内切酶应提供某种信息，通常消化前DNA中间长度至少应该三倍于消化产生的DNA中间长度；

②高分子的DNA容易造成消化不均匀，所以要用大体系酶切；而若酶切体系太大，消化后不方便上样，则可以对DNA进行浓缩，用乙醇沉淀DNA；

③电泳电泳前，除乙醇，并且70℃水浴，这样也可以破坏限制性片段黏性末端之间的碱基配对；

④消化后的DNA可以在4℃保存，但是电泳加样前需加热至56℃2~3分钟，破坏黏性末端碱基对；

⑤酶切后，电泳上样前最好通过荧光测量法测DNA消化产物的浓度；

⑥电泳前要保证DNA分散均匀，并且若是大分子量的DNA，要用大口径吸头吸取；⑦过夜电泳，低电压慢迁移率； ⑧电泳后将凝胶用溴化乙锭染色，读胶，用透明荧光尺读取迁移距离；

⑨电泳后的凝胶可以再4℃保存，但是不可超过一天。

3、Southern杂交技术中的膜转移有哪些注意点？

答：①凝胶、膜、吸水纸大小要适中，差不多大，不能太大，防止造成短路。并且各层之间不能有气泡；

②凝胶、膜都要做好标记，不能搞混；

③转膜前要对凝胶中DNA片段进行变性、洗涤等工作，若目的DNA片段大于15kb，则变形前还要进行短暂脱嘌呤处理，使DNA产生缺口，提高转移效率；

④不带电膜需用中性缓冲液，同时凝胶经变性后需用中性缓冲液洗涤；若是带点膜需用碱性缓冲液，则凝胶可直接进行转移，不需要变性。

4、Southern杂交技术中杂交部分的主要因素有哪些，分别有什么关系？

答：杂交步骤中主要因素有膜上的DNA量、探针量以及结合效率等；杂交的灵敏度可达到0.1pg，杂交信号强度与探针特异性活性呈正比，与探针长度呈反比。

5、Southern杂交技术中的探针有几种？实验室常用什么？

答：Southern杂交种使用的标记探针有同位素与非同位素标记两种。放射性同位素标记的探针灵敏度较高，但存在半衰期限制，并且实验验中操作者及环境都会受到放射性辐射的危害。所以实验室常用地高辛标记探针，目前市场已有相应的商品试剂盒，具体操作可以根据产品说明书进行。

6、Southern杂交技术中使用地高辛探针方法时除按照商品说明书流程进行操作外，还需要注意哪些技术要点？ 答：（1）探针的标记与使用：

①地高辛方法最好用PCR方法制备探针，同时若是模板DNA量足够多，则可用随机标记法。PCR法制备探针有时会出现非特异条带，特异性降低，所以之前要对PCR条件进行优化以保证特异性；

②要摸索探针的最适工作浓度。

（2）DNA样品的准备：

①DNA量要足够，一般不少于10μg，若产物中目的DNA浓度很大，则可适当按比例减少样品量；

②电泳判断样品是否完全消化。

（3）膜转移

①当目的基因的含量较低或转移基因组时，采用向下转移法能够提高转移效率和检测信号的强度；

②实验室一般采用紫外交联的方法对膜上DNA进行固定，此法快速、方便，但是操作中要避免膜被过量照射，并且将膜上带有DNA的一面朝向紫外光源。此步是为了使DNA的一小部分胸腺嘧啶残基与膜表面带正电荷的氨基基团形成交联。

（4）分子杂交：

根据所选择的预杂交液确定杂交温度，在满足温度条件的情况下，杂交的成败取决于杂交时间，时间果断则杂交不充分；时间过长则可能导致非特异性结合增多。杂交时间一般控制在20小时左右。

（5）祛除背景的方法：

①适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；

7、Southern杂交结果条带不清楚，可能是哪些方面的原因？

答：（1）膜上DNA量少。A、酶切消化时，要使样品完全消化，通过定时做电泳检测；B、电泳上样量一般不能少于10μg；

C、转膜后，若是不带电膜，则要进行固定DNA步骤，通过烘干、紫外照射等方法。

（2）探针的灵敏度及浓度问题。A、探针选用不合适；B、探针的浓度不合适，可能偏低。

（3）分子杂交步骤处理不当。A、分子杂交的时间不合适，可能偏短；B、杂交液量不合适，可能偏多；C、杂交环境温度不合适。

8、Southern杂交结果底色颜色太重，怎么办？

答：（1）减少杂交时间；

（2）减少探针的浓度；

（3）增加凝胶及膜漂洗的次数及时间；

（4）选用灵敏度更高的探针。

1、Southern杂交

（1）做Southern用杂交袋还是杂交管（瓶）好？

答：杂交管好用，首先杂交管不用担心气泡问题，而且膜可以均匀杂交，其次杂交管其实也用不了多少杂交液，只需要几毫升，在杂交炉里旋转就可以保证膜均匀杂交。

（2）细菌基因组酶切后的条带可不可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶来分离？然后再通过湿转印到尼龙膜上，一般要转印多久？

文献上一般都是通过0.8%左右的琼脂糖凝胶来分离的，但是通过传统的毛细管法转印到膜上比较麻烦，琼脂糖凝胶上的DNA能通过半干转印仪来转印吗？

答：首先不一定要用非变性聚丙烯酰胺凝胶来分离：Southern杂交目的就是要知道基因组中是否有想要的基因片段，并且可能还要知道此基因片段的位置是否与预期的一样，所以酶切基因组并杂交，其杂交条带的大小是很重要的指标，如果采用非变性聚丙烯酰胺凝胶，虽然大多数DNA的迁移率与其大小的对数值成反比，但迁移率也受碱基组成序列的影响，以致大小完全相同的DNA迁移率相差达10%，所以非变性聚丙烯酰胺凝胶不能用来确定DNA的大小。一般采用琼脂糖凝胶电泳。但是，如果不在意片段的大小，可以聚丙烯酰胺凝胶后采用电转的方法。电转的时间取决于片段的大小，凝胶空隙和外加电场的强度，可参阅电转移的说明书。其次是转移方法：基本上有三种：毛细管转移最常用也很稳定。电转移效果不好，必须使用带电的尼龙膜，温度可能会过热等等问题，经常是时而转不出来。真空转移效率高，但需要仪器。毛细管转移虽然麻烦，但没有条件的情况下最好用，而且非常稳定，大小片段都能转得很好。

（3）Southern杂交的时候用什么来做标记比较好呢?除了放射性元素以外。

答： 非放射性标记系统主要包括三大类：半抗原类、荧光色素类、酶类。其中半抗原类使用最为广泛，商品化选择最多。①半抗原类：主要有生物素(biotin)、地高辛、荧光素、二硝基苯(dinitrophenyl)、雌二醇、香豆素等，前三者使用最为广泛，且均有商品化试剂盒选用。②荧光色素类：主要包括荧光素、异硫氰酸荧光素、香豆素、德州红等。③酶标法：以Amersham Pharmacia公司开发的ECL系统为代表。它是在戊二醛的作用下将辣跟过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)与寡棱苷酸探针片断直接共价相连，此法简化了检测步骤，减少了非特异污染的可能。在这些系统中以新的荧光色素类标记物最具潜力。

非放射性系统的优势为：(1)安全、无污染、使用及后处理方便；(2)稳定性好，标记好的探针可保存一年甚至更久，降低工作强度、批次检测之间重复性好，为多样本或长期检测带来极大方便；(3)利用几种不同的探针标记方法，可一次对同一样本进行多探针杂交。

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