EMT核转录因子zeb1_zeb2及其调节因子miR-200s在大鼠肝纤维化及中

《中国图书资料分类法》 单位代码：10660

分类号：R361 学 号： B100010

贵 阳 医 学 院

2013届博士学位论文

EMT核转录因子zeb1/zeb2及其调节因子

miR-200s在大鼠肝纤维化及中药干预过程

中动态表达变化研究

研 究 生： 韩 冰

导 师： 程明亮 教授

年 级： 2010级

专 业： 病理学与病理生理学

2013年 3月20 日

目 录

摘 要 …………………………………………………… 4

引 言 …………………………………………………… 7

第一部分：大鼠肝纤维化形成及中药丹芍化纤胶囊干预过程中EMT发生及ZEB1/ZEB2、miR-200s动态表达变化研究

（一）大鼠肝纤维化形成过程中EMT发生及ZEB1/ZEB2、miR-200s动态表达变化

前 言 ……………………………………………… 11

材料与方法 ………………………………………… 11

结 果 ……………………………………………… 22

讨 论 ……………………………………………… 33

参考文献 …………………………………………… 36

（二）ZEB1/ZEB2及miRNA200s在中药丹芍化纤胶囊干预大鼠肝纤维化形成过程中表达变化研究

前 言 ……………………………………………… 39

材料与方法 ………………………………………… 39

结 果 ……………………………………………… 50

讨 论 ……………………………………………… 62

参考文献 …………………………………………… 65

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第二部分：TFG-β1诱导肝细胞EMT过程中ZEB1/ZEB2及其调节因

子miRNA200s表达变化研究

前 言 ……………………………………………… 69

材料与方法 ………………………………………… 70

结 果 ……………………………………………… 79

讨 论 ……………………………………………… 85

参考文献 …………………………………………… 87

结 语…………………………………………………… 89

英文摘要 ………………………………………………… 91

致 谢 ……………………………………………………95

略缩词表 ………………………………………………… 97

论文原创性声明 ………………………………………… 98

附：综 述 ……………………………………………… 99

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EMT核转录因子zeb1/zeb2及其调节因子miR-200s在大鼠肝纤维化及

中药干预过程中动态表达变化研究

专业：病理学与病理生理学 研究生：韩 冰 导师：程明亮 教授

摘 要

慢性肝病是一组严重危害人类健康的疾病，基本上所有慢性肝病均有肝纤维

化的病理改变，若不能加以控制或阻断进而可发展为肝硬化、或原发性肝癌。肝

纤维化（Hepatic fibrosis）的病理特征是以细胞外基质（extracellular matrix, ECM）

在肝脏内大量异常沉积为主。国际著名肝脏病学家Rogking明确提出人典型发展的

肝纤维化是完全可以逆转，因此，尽快阐明肝纤维化的发生机制，寻找到有效逆

转肝纤维化的方法或药物，成为近十年来世界肝病医学领域攻关中的热点课题。

近年来，随着分子生物学技术的发展，后基因组时代的到来及微小RNA的发现, 关

于肝纤维化和微小RNA（miRNA）作用关系的研究报道日渐增多。miRNA是一类

具有18-24个核苷酸的单链小RNA，它广泛存在于真核生物中，具有高度保守性、

时序性和组织特异性，对生命过程中的一系列重要进程有决定性调节意义。

miR-200家族（miRNA200s）由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429

共5个成员组成，大量研究证实miRNA200s可通过调节如锌指E盒结合蛋白

（zinc-finger E-box-binding homeobox ，ZEB）等核转录调节因子参与多种细胞的

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的过程从而达到调节脏器

纤维化发生发展的作用。但肝纤维化发生发展过程中EMT的发生和EMT核转录调

节因子ZEB家族表达变化，以及与miRNA200s可能的的调节关系尚未见系统报道，

本课题正是在此研究背景的基础上以阐明肝纤维化过程中ZEB1/ZEB2及其调节

因子miR-200s表达变化及其参与调节EMT的机制为目的，同时引入对肝纤维化有

明显防治作用的中药丹芍化纤胶囊作为干预，并在体外细胞水平进行了相关调节

机制的研究。

第一部分 大鼠肝纤维化形成及中药丹芍化纤胶囊干预过程中EMT发生及

ZEB1/ZEB2、miR-200s动态表达变化研究

目的 研究大鼠慢性肝损伤致肝纤维化及中药丹芍化纤胶囊干预过程中与上

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皮-间叶转化（EMT）调控相关因子微小RNA200家族成员及E盒结合锌指蛋白

1,2（zinc-finger E-box-binding homeobox1/2，ZEB1/ZEB2）动态表达变化。

方法 皮下注射四氯化碳（CCL4）复制大鼠慢性肝损伤致肝纤维化模型，分

别在2周、4周、6周和8周处死动物，干预组在皮下注射CCL4同时给予丹芍化

纤胶囊（0.5g/kg）灌胃，分别在4周、8周处死大鼠；计算肝脏指数、检测大鼠

血清ALT/AST含量；光镜下观察肝脏病理结构变化；采用实时荧光定量PCR方

法检测大鼠肝组织miRNA200s的表达变化；采用实时荧光定量PCR、免疫组织

化学方法、免疫印迹法(western blotting)从基因及蛋白水平检测E钙粘结蛋白

（E-cadherin）、平滑肌α肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、ZEB1与ZEB2

的动态表达变化。

结果 模型各组及干预4周组大鼠肝脏指数、ALT及AST含量皆明显高于正

常对照组（P<0.01）；8周模型组大鼠肝脏光镜下可见明显肝纤维化病理改变；模

型各组大鼠肝组织中α-SMA蛋白及mRNA表达量随着肝损伤及纤维化程度加重

逐渐增加，而E-cadherin蛋白及mRNA表达量则逐渐降低；模型2周组中

miRNA-200a、miRNA-200c、miRNA-141表达量皆明显高于正常对照组（P<0.01)；

模型4周组中miRNA-200a、miRNA-429表达量明显高于正常对照组（P<0.01)；

模型6周组中、miRNA200c、miRNA-141 mRNA表达量明显高于正常对照组

（P<0.01)；模型8周组中miRNA-200所有成员表达量皆明显高于正常对照组

（P<0.01),模型6周、8周大鼠肝脏组织中ZEB1与ZEB2蛋白（P<0.01）及mRNA

（P<0.01）表达量皆明显高于正常对照组。丹芍化纤胶囊干预4周、8周组大鼠

肝组织E-cadherin、α-SMA、ZEB1/ZEB2表达与同期模型组存在显著性差异

（P<0.05）；干预8周组大鼠肝组织内miR-200表达显著低于8周模型组（P<0.01）。

结论 EMT参与并促进了肝纤维化的发生发展；肝纤维化形成过程中EMT

的发生可能是通过miRNA200s与ZEB1/ZEB2表达变化调节的；在丹芍化纤胶囊

抑制肝纤维化发展过程中EMT的作用有所减轻；miRNA-200s与ZEB1/ZEB2可

能是丹芍化纤胶囊抗肝纤维化作用的新靶点。

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第二部分 TFG-β1诱导肝细胞EMT过程中 …… 此处隐藏：10449字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……